转基因动物技术应用研究进展

1 转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转

基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望

Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods. The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application; prospect

动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎, 2

也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的,通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。Haskell等[3]应用该方法制作了转基因牛。1.3 核移植法 该方法首先将外源基因导入到供体细胞中,选择其中带有外源基因的细胞进行扩增,然后将这种细胞的细胞核导入一个去了核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活将重组胚胎直接或进行体外培养发育到桑葚胚或囊胚后植入同步化的假孕动物的输卵管。1997年世界上第一头体细胞克隆羊“多莉”(DOLIY)在英国罗斯林研究所诞生,就应用了该法。安晓荣等[4]通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊。 1.4 人工酵母染色法 人工酵母染色法(YAC)是一种新型载体。其容量巨大,有克隆百万对碱基的大片段DNA的能力。此法可保证巨大基因的完整性,保证所有顺式作用因子的完整性和完整的结构基因位置的不变性,因此保证了长片段外源基因的整合率,可消除和减弱基因整合后的位置效应。Fujiwara等建立了210 kb YAC DNA转基因小鼠,在乳腺获得高水平表达人乳白蛋白,而未表现出普通转基因鼠所出现的位置效应。 1.5 性腺转基因方法 早期的动物转基因研究中, 大量应用了利用逆转录病毒介导、显微注射、电穿孔、脂质体介导、精子载体法等方法, 这些方法需要复杂的操作仪器和胚胎体外培养等复杂的实验过程, 同时获得转基因动物的效率很低, 一般不到10%。Kim et al[5]根据精子作为外源基因载体转基因的原理, 及一般细胞都能够吸收外源DNA 的原理, 把外源基因用脂质体转染精原细胞, 再将被转染的精原细胞微注射到精原细胞被破坏的雄性动物的睾丸的曲精细管内, 结果发现小鼠在康复后可以产生携带外源基因的精子。如果利用这样的小鼠对雌鼠交配, 可以预期能够产生含有所转外源基因的转基因小鼠。沈新明等省略了对精原细胞转染外源基因并对曲精细胞移植转染细胞的步骤, 直接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达载体注射到小鼠的曲精细管内, 最后通过与雌鼠交配, 成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。Yuan et al.报道向通过向曲精细管内注射外源DNA, 然后再结合对曲精细管电击或电穿孔处理, 以使外源基因进入睾丸生精细胞。然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配, 得到的小鼠中有一组的阳性检测率达25%。Shen et al.则将处理方法更为简化, 首先直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧光表达的外源DNA 及二甲基亚枫的介质, 使DNA能够进入睾丸细胞和生精细胞。一个月后用处理的雄兔与雌兔交配, 所产生后代的56%仔兔能高效地表达所导入的外源基因。这一转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法 3

的结果。对应于在雄性动物的向睾丸注射外源基因,Yang et al. [6]直接对小鼠的卵巢注射绿色荧光蛋白基因, 也可以得到转基因小鼠, 并且检测后代的阳性率达54%, 并且发现获得的6 代以内的转基因小鼠都具有较好的遗传稳定性。用同样的方法制作转基因鸡的研究中, 阳性率高达67.65%。由于通过性腺转基因操作简便、技术要求较低、难度较小, 这种方法将成为一个制作转基因动物的方向, 有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。然而该方法制备转基因动物时, 仍然存在外源基因随机整合进入与宿主基因组的问题, 因此目前还无法利用此方法随意地获得理想的转基因动物。 1.6 定点制作转基因动物的方法 由于非定点转基因方法使外源基因随机整合到宿主细胞染色体上, 使得制作转基因动物带有很大的偶然性, 外源基因的表达的可控性也较差。同时由于外源基因随机整合到宿主基因组, 很可能破坏宿主基因的正常表达, 将影响到宿主的发育和存活。因此新的定点整合转基因方法就应运而生了, 一般通称为基因打靶( gene targeting) 。 1.6.1 胚胎干细胞(ES 细胞)基因打靶方法 基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的可对基因组进行定点修饰的实验技术。基因打靶通过外源DNA 与染色体DNA 之间的同源重组、精细地定点修饰和改造基因DNA 片段, 具有位点专一性强和打靶后目的片段可以与染色体DNA 共同稳定遗传的特点。Thomas and Capecch[7]首先对小鼠ES 细胞进行了基因打靶, 然后将此打靶的ES 细胞移植进入小鼠囊胚, 将此重组胚胎移植进入代孕母鼠, 最后产出嵌合体仔鼠,通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。基因打靶包括基因敲除( knock out) 和基因敲入( knock in) 技术。目前利用以上技术已经制备了大量基因敲除小鼠, 在研究基因功能和疾病模型研究方面做出了贡献。相应地, 外源基因也可以通过基因打靶转入小鼠基因组, 并获得了通过基因敲入的转基因小鼠, 实现了外源基因在宿主基因组的定点整合。 1.6.2 对体细胞进行基因打靶 虽然ES 细胞具有全能性, 并且具有无限传代和增殖的能力, 但是由于目前尚未建立起一套有效的完善的适用于任何物种ES 细胞的分离和培养方法, 到目前为止很多物种尚未得到ES 细胞, 而体细胞便于采集、数量巨大, 并可以在体外增殖培养, 所以通过对体细胞进行基因打靶, 使外源性基因定点的整合到体细胞的基因组中, 再结合体细胞克隆来生产转基因动物将是一个不错的选择。McCreath etal.报道了用体细胞核移植生产出了基因打靶绵羊。Lai et al. 和Dai et al. 报道了用基因打靶及克隆的方法制作出了敲除α1,3- 糖苷转移酶的转基因猪, Kuroiwa et al.通过敲除牛朊蛋白( PRNP) 基因制作了无疯牛病的牛, 不会发生乳房炎的 4

奶牛和能够合成多不饱和脂肪酸的猪也被制备到。体细胞基因打靶结合克隆的方法早就定型, 问题是如何提高体细胞克隆的效率。对此, Kuroiwa etal.通过对基因印记较少和较为年轻化的胎牛成纤维细胞进行基因打靶, 细胞经过克隆后构建重组胚胎并移植到子宫内发育成2.5 月龄的胎儿, 再将此胎儿流产并再次分离出成纤维细胞, 对此进行重复打靶获得纯合型基因敲除细胞, 然后再进行克隆胚的构建和移植, 重组胚胎移植后怀孕45 d 的受胎率达到45%。此方法大大提高了基因敲除动物的制备效率, 经过5 次移植、流产、胎儿成纤维细胞分离、基因打靶和重构胚胎制备的循环, 在22 个月内生产了按传统方法需要6 年时间才能获得的纯合敲除PRNP 和IGHM 两个基因的牛。一般在体细胞克隆研究中都是制备异体克隆即提供细胞核的供体动物都不同于提供卵母细胞的受体动物。异体克隆胚胎可能由于基因印记可能导致核质相互作用的不协调, 致使目前制备克隆动物的效率都很低。为了解决这一问题, Yang et al.[8]把体细胞核移植入源于同一母牛的去核卵子, 克隆后激活的同体重组胚中基因重排要大大优于异体重组胚; 同体重组胚的囊胚发育率达38.5%, 高于异体胚的22%; 同体重组胚胎移植后克隆动物出生率达23%, 高于异体胚的5.6%。 1.6.3 对原始生殖细胞( PGC) 进行基因打靶 PGC 类似于ES 细胞, 具有发育全能性。PGC介导的转基因技术在原理和方法上与ES 细胞技术相似, 应用PGC 技术在制作转基因家禽方面有特别明显的优势。Brinster and Avarbock尝试了在雄性哺乳动物个体之间转移精原细胞的可行性, 研究者将设计好的Z FlacZ 系供体小鼠的PGC 植入C57BL6×STL 杂交一代小鼠的曲精细管, 经移植后的PGC 能够发育成具有受精能力的精子细胞, 并产生了后代。Mueller et al.报道从转基因猪分离和培养出的PGC 能用于制作嵌合体, 从而证实PGC 具有一定的嵌合能力, 也显示了利用PGC 进行转基因猪或其它大动物的可能性。禽类至今尚未得到ES 细胞, 其卵子和胚胎结构也不允许像哺乳动物那样进行胚胎克隆以生产转基因动物。但目前已经分离培养了多种禽类的PGC, 并且可以把PGC移植入发育中的胚胎的原始生殖腺并制作嵌合体禽类。van de Lavoir et al. [9] 将基因打靶的携带能表达绿色荧光蛋白基因的PGC注入孵化3 d 发育至13~15 期的鸡胚内, 获得8 只公雏, 成长后与母鸡交配产生7 只生殖腺有转入外源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。这一成功为今后进行禽类的定点转基因提供了示范。 2 转基因动物技术的应用现状 转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基因组,并能遗传给后代的动物。目前,转基因动物的研究主要包括三个方面:(1)利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造