流式细胞仪细胞分选的操作步骤
流式细胞仪的使用程序
流式细胞仪的使用程序------血液病实验诊断中心一.开机程序1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。
2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS 或FACSFlow),合上压力阀。
确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。
3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印,打开打印机电源。
5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。
7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。
二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x 轴和y轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。
4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。
. 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测, EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
流式细胞仪细胞分选的操作步骤细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
流式细胞仪操作方法
一、样品制备1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。
分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。
每个样品至少获取2×104cells，二、上流式测细胞1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。
检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。
将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。
如果需要打印，打开打印机电源。
打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。
1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。
若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。
关闭液流抽屉。
执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。
结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。
2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。
流式细胞仪操作方法
—、样品制备1、取样（大约lx cells ）,离心弃上清，以PBS 洗两遍，逐滴加入1 ml 70%的 冷乙醇固定细胞，-20°C 冻存过夜。
分析时，离心弃上清，以PBS 洗两遍，加入 100|j 啲Rnase （GenScript 试剂A ）, 37°C 水浴30min,然后再加入400』的PI 染 液（GenScript 试剂B ）,在4°C 避光条件下孵ff30min 后即可上FCM 检测。
每个样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞1」、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属扌当板；取出鞘液桶， 倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS 或FACSFLow ）,拧紧鞘液桶盖，安上金属扌当板，保证管路畅通无扭曲。
检查废液 桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液） 向废液桶中倒入400ml 浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。
确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。
1.2、 依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass 变Ac putput ）、变压 器电源，稳定5分钟。
将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应 是STANDBYo 如果需要打印，打开打印机电源。
打开电脑（密码：BDIS ）,等待 屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。
1.3、 将压力阀責于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。
若滤器管路中有气泡，打开连接 头，挤出鞘液，以排除气泡。
关闭液流抽屉。
执行仪器PRIME 功能一次，以排除 Flowce 呻的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流岀）。
结束后自动STANDBY, 5分钟后即可进行试验。
2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化，选散点图标，打开，Plot type 选择Acq-analysis, X 参数和丫参数分别取FSC-H 、SSC-H （选择散点图主要是确定 所需细胞的细胞群）。
FACSAria流式细胞仪无菌分选的基本流程
FACSAria流式细胞仪无菌分选的基本流程一、环境和液流的消毒1、准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。
PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。
2、房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。
二、开机和管道的消毒1、将 Sheath液换为活性氯浓度为0.5%的次氯酸钠溶液（不要用75％的酒精），开机。
开机前，先掀起流动室和分选室的罩盖，开启电源，打开计算机并等计算机进入WINDOWS系统后，打开激光电源，运行FACSDiva软件，联机成功后，执行Fluidics startup命令。
然后从FACSDiva的sort菜单进入sort setup，选择合适的液流压力（high、 middle、low）。
一般来说，100μm的喷嘴选用Low，而70μm的喷嘴选用middle。
2、打开breakoff window，点击显示窗上的液流开关，检查液流是否正好流入废液槽中间和液流的形态是否正常。
如果出现异常，可以通过调整喷嘴的位置，改变 Breakoff 窗口的Amplitude的大小和打开Attenuation开关等来进行调整。
（具体操作可参考Instrument User’s Guide的194－200页），直至液流形态和位置符合分选要求。
3、在上样管中装入1ml 活性氯浓度为0.5%的次氯酸钠溶液,将上样管放在上样架上，点击Acquisition窗口的Load开关，运行15－20分钟后，点击Unload 开关，取下上样管。
4、将Sheath液换为无菌PBS，先后执行Fluidics shutdown和Fluidics startup程序各一次。
通过上述操作完成了环境和管道的消毒，为分选准备了无菌的环境，在后续的操作中应注意保持，以确保分选样本不被污染。
流式细胞仪操作流程(单标)
流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。
（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。
3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。
以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。
4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。
三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。
2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。
3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。
4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。
流式细胞仪操作规程
流式细胞仪的使用程序分子病毒实验室一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。
2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFIow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3.将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5-10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印，打开打印机电源。
5.打开电脑 , 等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。
7.分析样品时，先用 FACAFIow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个 50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
预设获取模式文件(Acquisition Template Files)从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个1.获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和y 轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram （直方图）。
4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
. 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStationG3\BD Applications \CELLQuest \EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测， EXP用于细胞表面标志分析。
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细胞分选的简要操作步骤
一、上样前的准备
FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制）
5L无菌蒸馏水
5L无菌PBS
2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗
涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup。
在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。
按液流控制
键RUN。
10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直
至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。
重复
操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。
点击Pause, Abort。
25、在收集管接口处安装2支新的收集管。
若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌
PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。
26、按下述分选步骤分选样本
二、分选细胞
1、分选前应先做预实验，优化流式细胞仪的测定条件，建立分选门，具体操作步骤见
Cellquest操作步骤说明。
根据目标细胞的含量，调整流速和样品浓度，使目标细胞通过样品室的浓度为100-300个/秒，最好在200左右。
2、进入CellQuest,从Aquire菜单连机。
3、打开CellQuest中存储的获取窗口，打开优化后存储的仪器设置条件。
4、进样针处放上样本管。
5、可以先收集一个数据资料，将此数据与用分选后的样本收集的数据比较，以确定分选样本
的纯度。
6、从Acquire menu 选择Sort Setup。
7、依据样本中目的细胞的百分比及实验目的决定分选模式：在Sort Gate中选择分选用的
门，如选择No Gate （所有细胞）将只进行获取不分选；在Sort Count-中选择0 进行连续分选；在Sort Mode中选择Single Cel、Recovery、Exclusion的某种模式；在Aborted Cell 中选择不显示排除细胞数。
点OK。
8、点击液流控制键RUN。
9、点击获取控制窗口Aquire。
分选结束时点击Pause, Abort。
10、取下样本管，换上1mL蒸馏水。
点击获取控制窗口Sta ndby。
11、取下收集锥型管。
离心浓缩（300g 乂5min）,用培养液重悬，按实验所需条件进行培养。
三、上样后的清洗
分选结束后，为保证分选系统管路无腐蚀、无结晶、不堵塞、不染菌，必须进行管路的消毒与清洁，方法如下。
且一旦开始进行分选实验后，每周必须开机对分选管路用
无菌蒸馏水按照第一部分介绍的方法进行一次充分的冲洗。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制）
5L无菌蒸馏水
2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗
涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
8、从Acquire menu选择SortSetup。
在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。
按液流控制键RUN。
9、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
10、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。
11、再重复上述步骤2次，共需要1h。
12、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直
至洗净桶内壁残余乙醇。
13、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
14、在收集管接口处安装2支新的收集管。
15、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
16、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
17、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort
18、再重复上述步骤2次，共需要1h。
19、在鞘液筒中加入3L PBS（即鞘液），盖紧盖子。
安好鞘液筒。
20、放上一支装有PBS的进样管。
21、恢复过滤器的连接。
22、执行每日关机程序。