中药生物效应指纹图谱构建新思路——与微流控芯片技术的结合
指纹图谱技术在中药材质量控制中的意义与作用
中药的质量是其疗效的关键所在.长期以来，人们多是凭借经验，从药材的外观形态、气味以及一些简单的物理、化学现象来判断其真伪。
虽然起到一定的作用，但常常有很大的主观性和片面性.随着现代分子生物学技术的发展，中药材指纹图谱技术在中药材质量控制中显示了越来越广阔的应用前景。
(1)中药指纹图谱的概念和分类“指纹”(fingerpint）鉴定来源于法医学,每个人的指纹在微小的细节构造中各有不同，依据这些差异，通过“比对”方式，可以确定鉴别每个人的特征。
随着生物技术的发展,提出了DNA指纹图谱分析，主要是通过DNA指纹图谱，对人、动物、植物等生命体进行鉴别鉴定，乃至亲子鉴定等，扩大了指纹分析的含义，其意义主要表现在两个方面：一是成为指纹图谱。
指纹是以图像形式表现，而DNA指纹图谱是一些DNA片段所构成的条带图谱。
二是分析目的有所扩展,既可以像指纹分析一样作个体“唯一性”的鉴定，又可以鉴别确定整个物种的“唯一性”（多个个体之间的共性），还可以用作亲子鉴定,即判断个体之间的亲缘关系等。
中药指纹图谱则和DNA指纹图谱又有所不同。
1）中药指纹图谱的概念：中药指纹图谱（fingerprinting)借用DNA 指纹图谱发展而来，最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱，特别是高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。
HPLC具有很高的分离度，可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图,这些色谱峰的出峰位置和高度（或峰面积)分别代表了不同的化学成分和及其含量，整个色谱图表征了该样品所含化学成分的多少和量的大小。
如前所述，中药指纹图谱不同于法医学中的DNA指纹图谱。
常规意义下的指纹强调的是绝对的“个体特异性”，据此可对任何犯罪嫌疑人指证和控罪。
恰恰相反,中药指纹图谱赖以鉴别中药的药材真伪和质量优劣所要强调的却是作为药用植物物种的“共有特征性”.更值得指出的是，常规意义的“指纹”分析的依据主要是来源于先天的遗传，而中药药用化学成分的指纹图谱分析依据却主要来源于该植物物种后天的代谢产物，且大多为植物的次生代谢物。
中药指纹图谱研究进展
中药指纹图谱研究进展付京 倪健※（北京中医药大学中药学院，北京，100102）【摘要】中药指纹图谱是近年来的研究热点，其在中药质量控制方面得到了广泛的应用，已成为国际上公认的控制中药质量的评价模式，是研制开发“安全、有效、稳定、可控”现代中药的必要手段。
我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段，主要为使用各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱，使其能够评价和控制中药材及制剂的质量。
随着研究的深入，分析手段更加成熟，中药指纹图谱将在中药质量控制发挥更加重大作用。
本文对近年来中药指纹图谱的研究做如下综述。
【关键词】指纹图谱；质量控制；综述中药指纹图谱是一种新的中药质量控制模式，指将中药经适当处理，采用一定的手段，得到能标示该中药特性的图谱[1]。
中药指纹图谱的基本特征是系统性、特征性和稳定性，是一种综合的可量化的分析手段[2]。
中药指纹图谱的基本属性是整体性和模糊性[3]。
根据测定目标不同，分为中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱[4]。
中药质量评价过程中，将中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱相结合,将具有显著意义[5]。
1中药化学指纹图谱中药化学指纹图谱结合数理统计方法来评价中药材或制剂质量的优劣，通过各色谱峰的峰面积来确定样品中化学成分的相对量[6]。
色谱法是目前研究中药化学指纹图谱优先考虑的方法[7]。
公认的三种常规分析手段是薄层色谱、高效液相色谱和气相色谱[8]。
1.1 薄层色谱薄层色谱广泛被应用，因具有分析直观、速度快等特点。
王永生等[9]通过研究哈蟆油药材薄层图谱，科学评价及有效控制其质量。
薄层图谱显示不同品种有很高的相似性。
李彩君等[10]以高良姜素为对照品, 建立了高良姜药材的薄层色谱定性鉴别。
结果表明，本方法可以有效地鉴别高良姜, 并评价其质量。
李彬等[11]对解酒肝康颗粒中的主要药材进行薄层色谱鉴别。
结果表明，本方法分离度好, 专属性强。
1.2 高效液相色谱高效液相色谱是中药指纹图谱中应用最广泛最成熟的一类。
中药指纹图谱的原理与应用
三维荧光光谱指纹技术是研究样本的三 维荧光指纹特征，建立起对照品的三维 荧光指纹图谱，而不同的药物具有各自 特征的指纹图类型和特征指纹，药物的 荧光强度与其含量成正相关关系。因此， 荧光强度可作为药物含量评估的依据之 一。三维荧光光谱技术比常规荧光分析 方法更能反映激发波长和发射波长同时 变化时的荧光强度信息，而且具有灵敏 度高、选择性好等优点。
编辑课件
近10多年来发展很快的高效毛细管电泳技术(H PCE)是一种高效分离分析技术，以高压电场为 驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分 淌度和分配行为上的差异而实现分离。具有灵 敏度高、柱效高、分析速度快、所需样品量少、 溶剂消耗少和抗污染能力强等优点。不仅适用 于小分子酸、碱、盐及中性分子和生物大分子 如核酸、多肽、蛋白质等的分析，在中药有效 成分分析方面也显示出一定优势。
编辑课件
下面，对各种指纹图谱 分门别类加以介绍。
编辑课件
薄层色谱(TLC)由于操作简单，展开剂组成灵 活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑澜 的彩色图像，直观易辨，在中药鉴别中应用频 率最高。采用合格材料和标准操作，可得到高 质量的色谱图像，于同板同时比较鉴别多个样 品，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成 轮廓图谱，并给出各峰积分值，加大信息量， 从而提高综合分析能力，比较适合原料药材指 纹图像分析。由于薄层色谱法是一种开放系统， 外界影响因素较多，必然会增加实验的难度。
编辑课件
传统的质谱技术无法测定大分子(分子量超过2000Da)、 极性分子和难汽化分子的结构。电喷雾电离(electrospra y ionization，ESI)和基质辅助的激光解吸电离(matrix as sisted laser desorption ionization，MALDI)等软电离技术 使简便、快速、准确地研究生物大分子成为可能。目 前质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质和核酸 的核心技术之一。将中药提取物置于质谱仪中进行电 子轰击电离，可获得提取物中化学成分的EI-MS图。不 同中药提取物所含成分不同，所得质谱图显示的分子 离子峰及进一步的裂解碎片峰亦不一致，可用于鉴别。 MS法灵敏度及准确度高，指纹特征性强，常与HPLC、 GC联用。液相色谱可以起到脱盐和浓缩样品的作用， 减少盐或其它小分子对样品离子化的影响而降低样品 的损耗和污染。液相色谱与质谱在线联用使质谱法与 常规的蛋白质分析方法可以很好的联用，其精确度和 灵敏度都大大超过了常规方法。并且，快速流动的在 线分离技术是一种高效率的生物分析方法。用LC/ESI/ MS进行生物大分子的分析鉴定能获得满意的结果。
中药指纹图谱质控方法研究进展
中药指纹图谱质控方法研究进展中药指纹图谱是指通过一定的分离和检测技术，将中药中的多个化学成分在一定的条件下分离出来，然后通过对这些成分的检测结果进行分析和比较，得到一个图谱，并根据图谱来判断和评估中药的质量和药效。
中药指纹图谱质控方法的研究一直是中药研究的热点之一，现将该领域的研究进展进行总结和介绍。
中药指纹图谱的建立是中药质量控制的重要手段之一。
传统的中药质量控制大多是通过对中药主要有效成分的测定来进行的，这种方法存在着测定范围窄、测定结果受到样品中其他成分的干扰等问题。
而中药指纹图谱的建立，可以同时检测中药中的多个组分，从而更全面地评估中药的质量和功效。
中药指纹图谱还可以对中药进行溯源和鉴别，保证中药的来源和品质。
中药指纹图谱的建立对于中药质量控制具有重要的意义。
中药指纹图谱的建立是一个复杂的过程，涉及到中药的提取、分离和检测等多个环节。
目前，常用的中药指纹图谱建立方法主要有色谱法、电泳法和光谱法等。
色谱法是最常用的方法之一，包括高效液相色谱法、气相色谱法和毛细管电泳等。
色谱法的优点是分离效果好，灵敏度高，可以同时检测多个成分，但也存在着分析时间长、操作复杂等问题。
电泳法主要有毛细管电泳和等电聚焦等，电泳法具有操作简单、分离效果好等优点，但对样品的要求较高。
光谱法主要有紫外-可见光谱和红外光谱等，光谱法具有操作简单、分析速度快的优点，但对成分结构的要求较高。
还有一些新的技术被应用于中药指纹图谱的建立，如质谱法、核磁共振等。
中药指纹图谱的建立还需要进行数据处理和分析。
数据处理主要包括数据校正、峰识别和定量等。
峰识别是指对色谱图谱中的峰进行识别和归属，一般通过对比样品的峰面积和保留时间来确定峰的归属。
定量是指对中药中的成分进行定量测定，可以通过内标法、外标法和线性回归法等进行。
数据分析是指对图谱结果进行综合和比较，可以通过相似度分析、聚类分析和主成分分析等方法进行。
数据处理和分析的结果可以用来评估中药的质量和功效，并进行中药的质量控制和药效评价。
指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用
指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用【摘要】概述了中药指纹图谱技术在中药制剂研究中对于投料药材甄别、炮制工艺优化、监控生产工艺、质量控制等方面的应用，以及制剂谱效结合、指导新药研发方面的应用，展望了指纹图谱技术在中药制剂研究开发应用中的前景。
【关键词】中药指纹图谱技术制剂研究Abstract：This article reviewed the applications of fingerprint technology in preparation research of Chinese medicine, such as screening of the materia medica, optimization of processing technology, monitoring the production technology and quality control of the finished product. The combination of effect and chromatographic fingerprint, guidance in research and development of new drugwere also reviewed. It gives a good prospect of application of fingerprint technology in preparation research of Chinese medicine.Key words：Fingerprint of traditional Chinese medicine; Preparation research随着近年来“回归自然”的潮流在世界各国日益盛行，中药与天然药物受到国际医药界的广泛关注，成为研究开发的热点。
虽然我国有几千年应用中药的历史，但中药产业总体上仍处于较初级的发展阶段，中成药类贸易逆差显着，缺乏高附加值产品和优势品种。
中药指纹图谱技术及应用研究进展
2010 年第 1 期
中药指纹图谱技术及应用研究进展
张丁华, 王艳丰
( 河南农业职业学院动物科学系 , 河南中牟 中图分类号 : S853 7 文献标 识码 : A 451450) 文章编号 : 1000- 6354( 2010) 01- 0026- 03 磁共振法 ( NM R ) 、 质谱法、 DNA 指纹图谱等。方法虽多 , 但每 种方法均有一定特 点及 适用 范围 [ 1] 。其中 色谱 法是 主流 方 法 , 特别是 TCL 、 HPLC 和 GC 色谱技术 , 已成为公认的 3 种常 规分析手段 , 是目前研究中药指纹图谱应优先考虑的方法。 一种中药制剂指纹 图谱 可同时 采用 两种 或多种 方法 来 研究 , 在实际应用时可根据需要选 用。现行的 单一测定方 法 给出信息少 , 无法建立较完 善的指纹图 谱。从 20 世 纪 90 年 代始 , 人们开始尝试 建立多 维指 纹图谱 来解 决这 一问题 [ 2] 。 所谓多维即采用多种分析仪器联用的模 式来测定指 纹图谱 , 各图谱间相互补充 , 可对 复杂 供识品 有更 清晰完 整的 认识。 金宏等 [ 3] 用 GC- M S 法建立的草豆蔻挥发油共有图 谱 , 可 作 为评价其质量和鉴定 的依据。曹进等 [ 4] 用 LC /M S 法对桂 枝 汤 A 部分及组成桂枝汤的五味 单味药 的 A 部分进 行了多 维 全息化学特征谱指认 , 通过质谱的质 荷比值及 高效液相色 谱 中峰保留时间的相互对照 , 将桂枝 汤 A 部分中的主要成分 进 行归属。孙明谦等 [ 5] 应用 LC - ESI /M S 技 术对 血府 逐瘀 汤 中成分进行分析 , 并对其中的 10 种化学成分进 行确认 , 为 控 制血府逐瘀汤的质量、 稳定其疗效 等提供科学依据。 20 世纪 90 年代后期 , 液相色谱 - 核磁共振联用以 及液相色谱 - 核磁 共振 - 质谱联用技术相继出现 , 使得 液相色谱 的高分辨能 力 和核磁、 质谱等高鉴定能力相结合 , 对复 杂样品体系 , 特别 是 药物代谢的研究提供了更进一步的有效方法 [ 6] 。 2 指纹图谱技术在中医药方面的应用 中药指纹图谱可 用于中 药材 鉴定、 中药 炮制 方法 研究、 药材采收季节研究、 中药 制剂及 生产 工艺 研究、 药效 物质 成 分鉴定及中药活性成分测定等。 2. 1 在单味药中的应用 2. 1. 1 H PLC 法 刘婷娜等 [ 7] 利用 R P- HPLC 方法 , 分析了 12 批市售和 8 批采 自不同 产地的野 菊花药 材 , 在 45 m in 内 建立了野菊花 H PLC 指纹 图谱 , 确 定 了野 菊 花药 材中 的 22 个共有峰 , 归属了其 中的 黄酮类 化合 物 , 并对 其中黄 酮类 成 分进行主成分分析。黎琼 红等 [ 8] 利 用该 法以乙 腈 - 水梯 度 洗脱 , 以人参皂苷 Rg1 为参照物 , 通过对 11 批 云南省 3 个 地 区不同规格的三七样品 的测定 , 标 定了 15 个共 有峰 , 其相 似 度均在 0 . 99 以上。 黄月 纯等 [ 9] 通 过 对广 藿香 不同 部位 的 甲醇提取物成分进行 HPLC 指纹图谱 研究 , 重点考 察其不 同 部位有效成分含量的差异性 , 建立的 HPLC 指纹图 谱对广 藿
中药指纹图谱的建立方法及其应用进展
的有效方法 ， 给中药指纹图谱研究提供了新方向和平 台。
为了对 中药质量进行有效控制及药效研究及推广 ，推行
现代化的中药指纹图谱十分必要。
３ ． 气相 色谱 法
气相色谱由于其对挥发性成分的检测具有分离效率 高 、分析速度快、样品用量少 、检测灵敏度高和应用范 围广的特点 ，常用于有挥发性 的中药的成分检测分析 ，
能、低重现性 、低灵敏度等缺点 ，所 以如果 成分 复杂
现高效快速分离。毛细管 电泳法理论体系逐渐成熟后 ，
得到了迅速的发展 ，到 目前为止毛细管电泳法已有多种 分离模式 ， 如处理尽量降低 电渗流的毛细管区带电泳法 、
一
的中药 ，是很难用指纹图谱来鉴别 ，并对中药和制 剂
提出有效的质量评价 。
高效液相色谱法还可以连同其他 的检测器来分析各种类
型的样品。Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ与质谱分析以 （ ＭＳ ） 联用 ，在对 中药
分析时 ，不仅可快速得到中药图谱的指纹信息 ，还可同 时得到色谱峰的结构信息 ，因此 ，ｍ ・ Ｌ ｃ 与 ＭＳ联用 ，
成为得到中药指纹 图谱 的主导方法。采用 １ ． ７ ｍ 粒填料
毛细管 电泳法 因具有较少 的进样量 ，高灵敏度、高 柱效、满意的分析速度等优点而得到广泛 的应用 。毛细 管 电泳法是以毛细管为分离通道 ，依据进量样品中各组 分之间有着淌度和分配行为上的不同，以高压直流电场 为驱动力而实现分离析方法 ，对 中药 中复杂的成分可实
用之广泛 、实用性之大 。同其他鉴别方法一 样 ，虽然 指纹 图谱 同时能鉴别多个样品 ，但也有着 自己的低 效
２ ０ １ ５年 第 １ ５期
出现 了很 多假 冒伪 劣 商 品 ，而 中药 的有 效 成分 是衡 量 中
中药指纹图谱研究技术
（3）可建立多种方法的指纹图谱
（4）可选择典型样品的指纹图谱，或标准提取物的指纹图谱， 或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱
2.
指纹图谱标准的建立
（1）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入
起草说明 （2）10批供试品
（3）标准的规定：供试品的指纹图谱与对照提取物（标 准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指 纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相 对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相 对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。
中药指纹图谱 研究技术
中华中医药学会中药化学分会委员 周玉新
内
容
一、中药指纹图谱技术概述 二、中药指纹图谱研究指导原则 三、指纹图谱研究的相似度计算 四、中药指纹图谱的研究方法与思路 五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）
一、中药指纹图谱技术概述
（一） （二） （三）
中药指纹图谱与中药质量 中药指纹图谱研究方法学 中药指纹图谱技术的发展
（二）、样品的选择与收集
要求：
10个批次
道地药材与GAP基地药材 典型性与代表性 离散样品的剔除
（三）、供试品的制备
依据：
有效组分的物理化学性质 生产或提取工艺
检测方法的需要
（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路
1. 高效液相色谱法 2. 气相色谱法
HPLC GC
1.
高 效 液 相 色 谱 法
HPLC
3.
指纹图谱标准书写格式
液相色谱法 【指纹图谱】 照高效液色谱法（中国药典一部附录VI D），结 合指纹图谱的要求测定。 色谱条件及系统适用性试验 如以对照品做系统适用性试验， 则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验， 则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。 对照品溶液的制备 如有对照品则照中国药典书写格式。 供试品溶液的制备 精密吸取供试品溶液、对照品溶液（或对 照用提取物溶液）各 XX ml，分别流入液相色谱仪，测定。 本品指纹图谱的主要特征 供试品指纹图谱与质量标准所附的 对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相 似度大于 XX，符合要求（或相似度小于 XX，不符合要求）。
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中药生物效应指纹图谱构建新思路 —— 与微流控芯片技术的结合
史志兵, 蔡民民, 李建新*
南京大学化学化工学院, 南京 210093
【摘 要】 随着中药分析手段和信息技术的发展, 基于中药化学成分的指纹图谱技术已成为中药质量控制的重
要手段之一, 但如何更好地快速分析化学指纹图谱, 并将其与生物效应指纹图谱在线结合在一定程度上较全面地反
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互作用, 一般检测的分子的相对分子质量都在数千 左右。随着仪器设备的发展、实验方法的改进以及 数据处理手段的进步, 使得小分子(MWt <500 Da) 的 检 测 成 为 了可能[16], 最新的仪器每天可以分析 100~400 个样品。
传感芯片是 SPR 的核心组件, 传感芯片提供了 产生 SPR 信号的必需物理条件, 分子相互作用的研 究是在传感芯片表面进行的。一般首先将所要研究 的酶或蛋白质以合适的方式固定于芯片表面, 当含 有被分析小分子的载流缓冲液(被 LC 分离的化合物) 通过微流通道到达流通池与酶或蛋白质接触结合 时, 芯片表面基质的折射率增加, 导致共振信号上 升, 经过一系列的计算, 就能够得出结合速率常数 或解离速率常数。最后通入再生溶液(高盐、酸性或 碱性溶液等), 以破坏配体–受体结合, 使芯片再生, 进行下一个分析, 最后得到生物效应指纹图谱。图 3 显示了利用 SPR 检测通过 HPLC 分离得到的各个 峰的生物活性的理想装置。该装置的关键点是如何 合理地除去 HPLC 中的有机溶媒, 将化合物溶于合 适的载流缓冲液中, LC-NMR 可以给出一定的参考。
映中药质量仍然是中药现代化研究的关键科学问题。本文简单介绍了 LC-MS 和 LC-NMR 技术解析化学指纹图谱、
微流控芯片技术在生物效应检测中的应用, 分析了将微流控芯片技术与化学成分的指纹图谱技术相结合的可能性,
希望对我国中药质量研究起到推动和促进作用。
【关键词】 中药质量控制; 微流控芯片; 生物效应图谱; 化学指纹图谱
164 Chin J Nat Med May 2010 Vol. 8 No. 3
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图 4 浓度梯度装置及细胞培养微流控芯片 (据 Anal Chem, 2009, 81: 7075-7080 修改)
朱俊杰等与作者设计了一种利用量子点的药 物活性检测和快速筛选微流控芯片(图 4)[20]。利用 上游的浓度梯度装置调节药物浓度, 通过沙袋拦坝 捕获固定癌细胞, 检测了环己酰亚胺、依托泊苷和 喜树碱的活性。同时利用量子点 Annexin V 检测 细胞凋亡。结果与传统培养法相比, 量子点检测药物 孵育时间从 1 h 降到 5 min, 可以迅速进行药物筛选。
化学指纹图谱进行全面的在线分析[15]。 在明确化学指纹主要成分结构的基础上, 如果
能够在线检测这些分子的生物效应, 实现化学指纹 与生物效应指纹的耦合, 将有助于解决中药质量评 价中存在的关键问题, 极大地提高中药质量控制的 可靠性。微流控芯片系统, 经过十几年的发展, 已 经成为 21 世纪最为重要的前沿技术之一, 现已广 泛应用于生命科学、环境监测、食品分析等领域， 与传统检测方法相比, 具有高灵敏、高通量、样品 和试剂耗量小等优点。
图 2 E. vogelii 的二氯甲烷提取物 On-flow LC–NMR 图 (据 J Chromatogr A, 2002, 974: 123-134 修改)
2010 年 5 月 第 8 卷 第 3 期
Chin J Nat Med May 2010 Vol. 8 No. 3 163
史志兵，等/
同样, 多通道微流控芯片也可以用于生物效应 指纹图谱的建立[19]。
3 基于微流控芯片的在线细胞效应检测
细胞作为生物有机体结构和功能的基本单位,
其生物学功能多样复杂。药物研发和化合物的生物 活性检测, 常常使用细胞培养系统。由于微流控芯 片的微通道宽度(10~50 μm)和生物细胞大小相当, 随着生命科学的飞速发展, 利用微流控芯片系统对 细胞、单细胞或细胞内的成分和形态变化进行分析 和检测已成为研究的热点。而且生物细胞在微通道 内容易操纵、观察和检测, 利用微流控芯片进行细 胞培养生物活性研究具有独特的优越性。
2010 年 5 月 第 8 卷 第 3 期
史志兵，等/
但是由于中药成分的复杂性, 目前大部分的报 道只是给出图谱, 对化学指纹图谱中每一个或大部 分信号峰所表示的成分的结构难以解析确认。所幸 的是 LC-MS 和 LC-NMR 技术给中药化学指纹图谱 的分析提供了根本的解决办法。同样生物活性检测 常常使用如酶、细胞等手段, 使得单一的基于化学 反应的检测手段难以应对生物效应形式的多样性。 另外由于色谱分离得到每个峰所含的化学成分非 常少, 如何实现对酶及细胞水平的生物活性在线分 析面临挑战。
本文对使用 LC-MS 和 LC-NMR 分析化学指纹 图谱, 微流控芯片与色谱分离实现在线生物效应检 测的思路、技术的可能性及关键问题进行分析, 期 待能在获得化学指纹图谱详细信息的基础上, 为实 现化学与生物效应指纹图谱的在线整合提供新的 思路, 为中药质量评价提供新的方法学。
1 基于 LC-MS 和 LC-NMR 技术的化学指纹 图谱的在线全面分析
【中图分类号】 R917
【文献标识号】 A 【文章编号】1672-3651(2010)03-0162-05
doi: 10.3724/SP. J. 1009.2010.00162
单一中药(天然药物)其成分众多,即使是相同 的中药，受气候、土壤、生态环境等因素及不同产 地、不同采收季节或加工方法不同的影响, 其化学 成分会有一定的区别[1]。尤其是中医一般使用中药 复方, 其成分就更为复杂, 但是质量控制是药物的 最基本要求之一。随着中药分析手段和信息技术的 发展, 基于色谱技术及化学成分的“中药指纹图谱 技术”已成为中药质量控制的重要手段[2-3]。该技术 能较为全面地反映中药所含的化学物质群, 以确保 产品质量的稳定性。指纹图谱技术对推动中药现代 化的发展, 促进中药农业的产业化, 提高中药原料 质量作出了重要的贡献。但是“中药指纹图谱技术” 研究的是中药主要化学成分, 只是反映中药的化学 成分信息, 各化学成分量的多少有时很难与活性的 强弱有直接的关系。因此化学指纹图谱技术孤立于 生物效应之外, 没有涉及到与生物效应相关的有效 成分, 即中药药效物质基础。毫无疑问，分离获取 化学指纹图谱中的每个成分, 测试其生物效应, 可 以很好地反映中药的质量, 但是需要相当的人力、 物力和财力。理想的技术是在中药药效化学物质复
图 1 基于 LC-UV/MS 及 LC-NMR 的色谱峰成分结构 分析 (据 J Chromatogra A, 2003, 1000: 437-455 修改)
Queiroz 等利用 LC-MSn 和 LC-1H NMR 的 on-flow 方式对刺桐属植物 Erythrina vogelii (Leguminosae) 的提取物 HPLC 中的主要峰进行了 分析, 结果高效准确地鉴定了所表示成分的结构 (图 2), 揭示了利用 LC-MS 和 LC-NMR 技术可以对
如上所述, 目前中药的化学指纹图谱有一大部 分只是给出一个色谱峰的集成, 缺乏对主要色谱峰 所表示的成分的分析。如果能够实现对化学指纹图
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谱大部分峰所表示成分的明确解析, 将会极大地提 高图谱的价值和功能。勿庸置疑, 解决该问题, 使 用对中药提取物的成分进行分离、结构鉴定的常规 研究方法效率过低甚至无法有效地发挥作用。由于 常用中药的主要化学成分已经基本分析清楚, 结合 UV 或 DAD 图谱, 利用成熟的高效灵敏的分析方法 — 液 相 质 谱 联 用 LC-MS 或 多 级 质 谱 联 用 LC-MSn 技术, 对色谱峰所表示的成分结构进行推 测表征已经不是非常困难(图 1)。由于现在结构表 征最常用的有力手段为 NMR, 因此 LC-NMR 在鉴 定结构尤其是具有相同骨架的同类化合物, 鉴别新 组分结构类型,以及在化合物的快速鉴定筛除等方 面显示了不可替代的作用。因此 LC-NMR 作为上 述 LC-MS 技术的补充, 如果能够实现优势互补, 至 少可实现化学指纹图谱的主要色谱峰的结构分 析[13-14]。
杂的背景下, 利用色谱或其他分离手段, 将其 化学组成进行快速分离, 同时实现生物效应活性 (online)检测的耦合,即在获取化学指纹图谱的同时 得到与化学指纹相对应的生物效应指纹图谱, 以评 价中药的质量。因此, 如何在建立能够较好地反映 中药中化学物质组成方法的同时, 又能了解相关化 学物质的生物效应, 从而达到较为全面控制中药整 体物质群, 评价中药质量和研究中药复方, 已成为 中药研究的热点之一。
微流控芯片(microfluidic chip) 或称微全分析 系统 (micro total analysis system, μTAS)是将采 样、预处理、加试剂、反应、分离和检测等集成在 微芯片上进行的一门新技术。该技术具有体积小、 操作简单、样品用量少、分析速度快、操作易自动化 等优点[10], 不仅可以实施化学分离, 而且能够进行酶 及细胞的分析[11-12]。微流控芯片近几年来发展极其迅 速, 也为实现中药生物效应的在线分析提供了机会。
2 基于 SPR 传感芯片的在线酶/蛋白质效应 检测
表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一种物理光学现象。该技术两个最明显的 优势是实时检测和无需标记, 同时具有分析快捷、 灵敏度高、前处理简单、样品用量少等优点, 已被 广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食 品安全和环境监测等领域, 并且显示出广阔的应用 前景。SPR 技术最初用于检测生物大分子之间的相
图 3 LC-SPR 装置示意图
利用 SPR 研究小分子与酶相互作用有不少报 道。Kampranis 等研究了香豆素以及 cyclothialidine 药物(MWt < 700 Da)和野生突变型 DNA 旋转酶结 合的动力学[17]。这些高亲合势的药物－蛋白相互作 用(KD = （1-150） nmol·L−1)显示了旋转酶上的哪 些残基是对药物结合有作用的。与之相反, Strandh 等论证了对低亲合势的检测(KD ~1 mmol·L−1), 研 究了 saccharides (MWt < 800 Da)和抗体的相互作用 [18]。SPR 技术能够检测强和弱结合的能力, 使得这 种技术在生物效应指纹图谱分析中有特别的意义。