重叠群物理图谱的构建及其应用_汤飞宇

基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第195－201页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,195－201专题介绍Review重叠群物理图谱的构建及其应用汤飞宇1,2张天真1*1南京农业大学棉花研究所,作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京,210095;2江西农业大学农学院,南昌,330045*通讯作者,cotton@摘要人类对各种生物的基因组结构和功能的研究都需要确定DNA序列在染色体上的位置。

与遗传图相比，物理图反映了基因或DNA标记之间在染色体上的真实距离。

依其作图方法分为三类，即限制性酶切图谱、重叠群图谱和DNA序列图谱。

重叠群物理图是将获得的大片段克隆，如YAC、BAC克隆，依其在染色体上的真实顺序排列而成，主要应用于基因组测序、重要基因的图位克隆、靶分子标记开发及比较基因组学研究等，特别是为那些由于缺乏合适的作图群体而不能建立遗传图的物种提供了一个重要的从事基因组学研究的平台。

本文综述了近年来重叠群物理图构建研究的主要进展，比较分析了不同重叠群物理图谱构建方法的特点，提出了改进物理作图质量的建议，认为应根据基因组不同区域的特点，综合特异性探针的杂交、PCR筛选、酶切指纹分析、BAC克隆STC延伸、BAC末端测序等多种方法才能完成重叠群的构建。

此外，物理图的构建还应努力整合各种基因组的资源和数据，如遗传连锁图、分子细胞遗传图、DNA序列图、EST数据等，这将有助于提高其在基因组学研究中的使用价值及应用范围。

文章最后对重叠群物理图的发展趋势进行了展望。

关键词物理图谱,基因组,重叠群Construction and Application of Large-insert Clones-based Physical MapTang Feiyu1,2Zhang Tianzhen1*1Institute of Cotton Research,Nanjing Agricultural University,National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing, 210095;2College of Agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang,330045*Corresponding author,cotton@Abstract The locations of DNA sequences in chromosomes need to be identified for the study of genome struc-ture and pare to genetic maps,physical maps reflect the real distance among genes/DNA markers in chromosomes,which are classified into three types according to mapping methods,i.e.restriction endonuclease map,contig map,and DNA sequence map.A contig is a chromosome map showing the locations of those regions of a chromosome where contiguous large-insert clones overlap.It is essential for genome sequencing,position cloning of agronomically important genes,comparative genome analysis,target DNA marker development etc., and provides an important genomics research platform even for those species for which development of genetic maps is impossible owing to the absence of appropriate mapping populations.This review summarized recent progress on the construction of genome contig maps.On the basis of comparative analysis of the major physical mapping methods and the structures of different regions of chromosomes,it was concluded that a combination of two or more strategies,such as overgo hybridization,restriction fingerprint analysis,mapped DNA marked-based chromosome landing,BAC clone ends sequencing,and sequence-tagged connectors(STC)approach etc.,will greatly facilitate genome physical mapping.Moreover,various genome resources and data should be integrated into contig maps including genetic maps,molecular cytogenetic maps,genome sequencing data,expressed sequence tags (ESTs)etc..The integrated genome maps will contribute to the more extensive application and enhanced utility of themselves in genome research.The current application and future prospects of contig maps are also discussed. Keywords Physical map,Genome,Contig基金项目：本研究由中国博士后科学基金(20070410339)和江苏省博士后科学基金项目(0602024B)资助基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology 在作物育种中，高产、优质和多抗等性状的同步改良是育种家孜孜不倦研究的课题。

控制作物各类优良性状的遗传信息包含在其基因组之中，依靠基因组测序可以认识通过一般遗传学手段难以被察觉的大量可能存在的优良基因。

限于当前的科学技术水平和条件，科学家还不能对复杂的大基因组如水稻、小麦、棉花基因组直接进行测序，也无法对构成它们的任何一条染色体直接进行测序，但通过重叠群物理图能解决这一问题。

随着大片段基因组文库和分子连锁图构建技术的建立和完善，作物的重叠群物理图的构建取得了较快的进展。

如水稻、高粱、大豆、玉米、棉花等农作物全基因组或部分染色体的物理图已构建完成(Chen et al.,2002;Klein et al., 2000;Wu et al.,2004;Coe et al.,2002;Xu et al., 2008)，为进一步开展功能基因组学的研究提供了重要的平台。

1重叠群物理图的构建策略物理图谱(physical map)是将基因组以DNA片段或核苷酸序列排列而成的图谱，反映了染色体上基因或标记间的实际距离，依其产生的方法不同分为三类：限制性酶切图谱、重叠群图谱(contig map)和DNA序列图谱。

限制性酶切图谱是指限制性酶切位点在DNA 分子上的分布图，DNA分子上的酶切位点可以作为一种DNA标记定位重要的特征区域。

重叠群图谱是将一套部分重叠的大片段基因组DNA分子(YAC yeast artificial chromosome,BAC bacterial artificial chromosome克隆等的插入片段)依其在染色体上的位置顺序排列，不间断地覆盖着染色体上一段完整的区域。

DNA序列图谱显示基因组的全部核苷酸序列，从某种意义上讲，也是一种重叠群图谱，只是它的分辨率达到了碱基水平。

本文要讨论的是重叠群物理图的构建，其步骤是先确定克隆之间的相互重叠关系从而得到物理图的基本框架—重叠群，再借助染色体特异性的分子标记将重叠群定位在染色体上。

常用的方法如下所述。

1.1菌落杂交法菌落杂交法(colony hybridization)随机选择大片段克隆，末端测序设计探针与文库杂交；选择第一轮未被杂交的克隆作探针重复进行第二轮杂交；如此循环往复直至文库中所有的克隆最后都被杂交上。

能与同一探针杂交的克隆构成重叠群，重叠群通过遗传座位明确的分子标记或特异性探针整合到遗传图上(Mozo et al.,1999)。

很显然此方法受到基因组重复序列丰度的显著影响，尽管该策略已成功的运用于拟南芥BAC物理图的构建(Mozo et al.,1999)，但拟南芥基因组小(130Mb/1C)、重复序列比例低，对于具有复杂基因组、重复序列含量高的物种利用杂交法构建物理图的难度较大。

1.2分子标记法分子标记法(mapped DNA marker-based chromo-some landing)利用遗传图的RFLP探针或STS/SSR 引物筛库，对应于同一遗传位点的不同克隆必然拥有共同的核苷酸序列，表明它们的插入片段存在重叠区，根据这一原理可以组建重叠群。

这种策略已经应用于水稻基因组，果蝇第2号及第3号染色体物理图的构建(Saji et al.,2001;Hoskins et al.,2000)。

如Saji等(2001)构建的水稻基因组YAC物理图，利用遗传图上的1439个DNA标记共筛选到1892个YAC克隆，形成了297个YAC重叠群及142个岛(islands,在一个单独的分子标记处有多个YAC重叠着)，这些重叠群和岛的总物理长度估计为270Mb，覆盖了整个水稻基因组的63%。

该策略的优点在于能够实现物理图与遗传图的整合，前提是要有高密度的遗传图及克隆的插入片段足够长。