蛋白质分子基础3-蛋白质制备
生物化学与基础分子生物学实验
生物化学与基础分子生物学实验本实验旨在增进学生对于生物化学与基础分子生物学知识的理解，同时也希望借此机会增强学生的实验动手能力和实验数据分析能力。
本实验主要分为两部分，第一部分是生物化学实验，主要包括蛋白质的提取、纯化和酶促反应的研究。
第二部分是基础分子生物学实验，主要涉及DNA的提取、PCR扩增和凝胶电泳检测等。
一、生物化学实验1. 蛋白质的提取蛋白质的提取是研究蛋白质功能和结构的基础。
常用的蛋白质提取方法有机械破碎法、化学破碎法和生物学破碎法等。
本实验以细胞生物学破碎法为主要方法，即利用超声波或手工研磨等方法将细胞破碎。
其中，手工研磨可以选择石英砂或三氧化二铬等研磨介质。
破碎过程中需加入适量浓度等渗液和抑制剂，以防止蛋白质的降解和氧化。
2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化是进一步研究蛋白质结构和功能的关键。
常用的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、透析、亲和层析和电泳等方法。
本实验以离子交换和凝胶过滤为主要方法。
其中，离子交换可利用正离子交换和负离子交换两种模式进行，考虑到蛋白质电荷状态的不同以及离子交换树脂的不同选择，从而使得目标蛋白质与其它蛋白质的区分度大大增加。
凝胶过滤则利用凝胶的孔径大小进行分离纯化。
3. 酶促反应的研究酶促反应是生物化学研究的重要组成部分，可以研究酶的特性、动力学以及酶对于特定底物和抑制剂的亲和性等。
本实验选择酶促细胞色素C氧化为模型反应。
反应中需要考虑诸多因素，如温度、pH、反应时间等，同时还需考虑反应体系中酶、底物和抑制剂的摩尔比例关系。
二、基础分子生物学实验1. DNA的提取DNA的提取是基础分子生物学实验的关键步骤，其目的是提高纯度和量。
常用的DNA提取方法有化学法、机械法、热平衡法和离心法等。
本实验以盐酸摇法为主要方法进行DNA的提取。
其中将细胞经过适当处理后加入盐酸和β-己糖苷酯，在恒温和摇动条件下分离得到DNA。
2. PCR扩增PCR是分子生物学中的核心技术之一，是一种复合酶链反应。
理学蛋白质分子设计
• 先讲理论 • 后面举几个例子
蛋白质分子设计策略
• 理性设计策略
– 前提:充分了解结构与功能的关系
• 随机突变+功能筛选
– 前提:不了解结构与功能的关系
• 理性设计+随机突变+功能筛选
– 前提:不完全了解结构与功能的关系
分子设计的种类
小改：少数残基的替换，突变或修饰 中改：分子拼接，肽段或结构域的替换 大改：从头设计，全新蛋白质的设计
具体方法：
利用R55受体的结构 模建R75受体的结构
根据淋巴毒素与R55 的作用情况，模拟肿 瘤坏死因子与R55受 体的相互作用情况。
根据肿瘤坏死因子与 R55受体的相互作用 情况，模拟肿瘤坏死 因子与R75受体的相 互作用情况。
Gln67与R55作用不明显，但与R75的Asp有静电作用， 将它突变为结构相似但带电相反的Glu会降低TNF与 R75的作用，但不会改变与R55的作用。
0 0.02 0.2 2 20 200
Protein (ng)
mTSA BSA SEA
融合蛋白与A431细胞结合的剂量曲线
mTSA与A431细胞结合的特异性试验 A.Positive control EGF; B. pmTSA ; C. mTSA binding blocked by EGF; D. Blank control :PBS
基于结构的药物设计
确定靶蛋白的结合口袋，以结合口袋的结构环境设 计药物； 未知受体结构时，根据具有相同或相似生物学活性 的已知化合物的结构叠合，反推受体结合口袋的可能 结构环境，根据推测的受体结合口袋进行新型药物设 计。
蛋白质分子的模拟肽设计
骨架残基设计，肽库筛选 以结构为模板的分子设计。
提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。
下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。
1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。
样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。
在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。
2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。
通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。
常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。
3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。
裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。
常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。
4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。
常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。
5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。
常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。
常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。
以上就是提取蛋白质的具体步骤。
通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。
希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。
提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。
下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。
1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。
样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。
2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。
常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。
3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。
蛋白的制备
蛋白的制备全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白是生物体内不可或缺的重要分子，它们参与了身体的生长发育、免疫防御、组织修复等多种生理功能。
在科学研究和工业生产中，制备纯净的蛋白是基础工作之一。
本文将介绍蛋白制备的基本原理、常用技术方法以及相关注意事项。
一、蛋白的结构和功能蛋白是由不同种类的氨基酸残基通过肽键连接而成的长链状分子。
它们可以折叠成特定的空间结构，从而实现各种功能。
蛋白的结构可以分为四个层次：一级结构是氨基酸序列的线性排列；二级结构是α螺旋或β折叠等局部结构；三级结构是各个结构域的整体折叠；四级结构是多个蛋白互相组装而成的复合体。
蛋白具有多种功能，如酶的催化作用、抗体的免疫防御、激素的信号传递等。
研究蛋白的结构和功能对于认识生物体的生命活动至关重要。
二、蛋白的制备原理蛋白的制备过程一般包括以下几个步骤：提取、纯化、结构鉴定和功能分析。
首先是蛋白的提取，即从生物体内分离出目标蛋白。
提取方法一般包括机械破碎、化学溶解和生物学方法等。
接下来是蛋白的纯化，通过不同的技术方法，如柱层析、凝胶电泳、超滤等，将目标蛋白从混合样品中分离出来。
然后是结构鉴定，利用质谱、X射线晶体学等方法确定蛋白的三维结构。
最后是功能分析，通过酶活性测定、配体结合实验等手段研究蛋白的功能。
三、常用的蛋白制备技术1.柱层析法柱层析法是一种基于蛋白分子大小、电荷、疏水性等特性的分离技术。
常用的柱层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、金属螯合层析等。
通过选择合适的柱和缓冲液条件，可以实现对蛋白的高效纯化。
2.凝胶电泳法凝胶电泳法是一种将蛋白按照大小、电荷分离的技术。
常见的凝胶电泳包括SDS-PAGE、原位电泳、双向电泳等。
通过凝胶电泳可以对蛋白进行定性和定量分析，为后续的进一步纯化和结构鉴定提供依据。
3.超滤法超滤法是利用不同孔径的超滤膜将混合液中的蛋白筛选出来的技术。
超滤法可以快速分离大分子和小分子，是一种高效的蛋白纯化方法。
蛋白质提取与纯化技术
蛋⽩质提取与纯化技术蛋⽩质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋⽩质和结构与功能为基础，从分⼦⽔平上认识⽣命现象，已经成为现代⽣物学发展的主要⽅向，研究蛋⽩质，⾸先要得到⾼度纯化并具有⽣物活性的⽬的物质。
蛋⽩质的制备⼯作涉及物理、化学和⽣物等各⽅⾯知识，但基本原理不外乎两⽅⾯。
⼀是得⽤混合物中⼏个组分分配率的差别，把它们分配到可⽤机械⽅法分离的两个或⼏个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；⼆是将混合物置于单⼀物相中，通过物理⼒场的作⽤使各组分分配于来同区域⽽达到分离⽬的，如电泳，超速离⼼，超滤等。
在所有这些⽅法的应⽤中必须注意保存⽣物⼤分⼦的完整性，防⽌酸、硷、⾼温，剧烈机械作⽤⽽导致所提物质⽣物活性的丧失。
蛋⽩质的制备⼀般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、⼲燥和保存。
微⽣物、植物和动物都可做为制备蛋⽩质的原材料，所选⽤的材料主要依据实验⽬的来确定。
对于微⽣物，应注意它的⽣长期，在微⽣物的对数⽣长期，酶和核酸的含量较⾼，可以获得⾼产量，以微⽣物为材料时有两种情况：（1）得⽤微⽣物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利⽤菌体含有的⽣化物质，如蛋⽩质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和⽣长发育状况不同，其中所含⽣物⼤分⼦的量变化很⼤，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进⾏绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不⽴即进⾏实验，应冷冻保存，对于易分解的⽣物⼤分⼦应选⽤新鲜材料制备。
蛋⽩质的分离纯化⼀，蛋⽩质（包括酶）的提取⼤部分蛋⽩质都可溶于⽔、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋⽩质则溶于⼄醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采⽤不同溶剂提取分离和纯化蛋⽩质及酶。
（⼀）⽔溶液提取法稀盐和缓冲系统的⽔溶液对蛋⽩质稳定性好、溶解度⼤、是提取蛋⽩质最常⽤的溶剂，通常⽤量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋⽩质的溶解。
蛋白质分子基础肽的人工合成
肽键的形成
活化
通过酸或碱催化剂将氨基酸羧基激活，以便与另一个氨基酸 的氨基进行反应。
缩合
活化的氨基酸羧基与另一个氨基酸的氨基发生缩合反应，形 成肽键。
肽链的折叠与组装
肽链的折叠
在特定的环境下，肽链通过非共价键相互作用，自发地折叠成特定的三维结构。
肽链的组装
将多个肽链按照特定的方式组装在一起，形成具有特定功能的蛋白质分子。
解决方法
为了优化蛋白质的功能，可以采用计算机辅助设计的方法，模拟天然蛋白质的结构和功能，并进行人工设计和改 造。此外，还可以通过定向进化技术，对蛋白质进行随机突变和筛选，以获得具有优良功能的突变体。
蛋白质大规模生产问题
蛋白质大规模生产问题
在人工合成蛋白质时，还需要解决大规 模生产的问题。由于蛋白质的合成需要 大量的时间和资源，因此大规模生产时 需要提高合成效率和降低成本。
蛋白质分子基础肽的 人工合成
目录
• 蛋白质分子基础肽人工合成概述 • 蛋白质分子基础肽的合成过程 • 蛋白质分子基础肽的人工合成应用 • 蛋白质分子基础肽人工合成的挑战与前景 • 蛋白质分子基础肽人工合成的发展趋势
01
蛋白质分子基础肽人工 合成概述
蛋白质分子基础肽人工合成定义
• 蛋白质分子基础肽人工合成是指通过化学或生物酶促的方法， 将氨基酸按照特定的序列连接起来，形成具有特定结构和功能 的肽或蛋白质的过程。
03
蛋白质分子基础肽的人 工合成应用
药物研发
药物靶点发现
药物优化
通过人工合成蛋白质分子基础肽，可 以模拟蛋白质的特定功能区域，用于 发现新的药物靶点。
在药物研发过程中，人工合成的蛋白 质分子基础肽可以用于对药物进行结 构优化，提高药物的活性和选择性。
蛋白质的研究方法
蛋白质的研究方法蛋白质是生物体中非常重要的生物分子，研究蛋白质有助于了解其功能、结构和相互作用等方面的信息。
为了研究蛋白质，科学家们发展了许多方法和技术。
本文将介绍一些常用的蛋白质研究方法。
1. 分离和纯化蛋白质通常与其他生物分子混合存在，因此首先需要将其从混合物中分离出来。
分离和纯化蛋白质的常用方法包括盐析、凝胶过滤、离心、电泳和亲和层析等。
这些方法利用蛋白质的理化性质，如电荷、大小、溶解度等，进行分离和纯化。
2. 免疫学技术免疫学技术用于检测、鉴定和定量蛋白质。
常见的免疫学方法包括免疫印迹、免疫组织化学、免疫沉淀和流式细胞术等。
这些方法利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，来检测和分析蛋白质。
3. 质谱分析质谱分析是一种高分辨率的分析技术，可用于确定蛋白质的质量、序列、结构和修饰情况等。
常用的质谱方法包括质谱仪、飞行时间质谱、串联质谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等。
这些技术通过将蛋白质分子分离和离子化，测量其质量和离子信号，来分析蛋白质的性质。
4. 核磁共振核磁共振（NMR）是一种能够测量蛋白质在溶液中的空间结构和动力学特性的方法。
通过测量核自旋的相对位置和取向，可以确定蛋白质的三维结构和分析其与其他分子的相互作用。
NMR在研究蛋白质结构、构象变化和动力学等方面具有重要的应用价值。
5. X射线晶体学X射线晶体学是一种通过蛋白质晶体对入射的X射线进行衍射来确定蛋白质三维结构的方法。
这种方法需要制备蛋白质的晶体，并使用X射线衍射仪测量晶体的衍射图样。
通过分析衍射图样，可以推导出蛋白质的原子级别结构信息。
6. 生物物理化学方法生物物理化学方法用于研究蛋白质的结构和功能。
常见的方法包括荧光光谱、红外光谱、圆二色谱、散射和色谱等。
这些方法利用光学、电磁和物理学原理，测量蛋白质的光学性质、构象特征和相互作用等信息。
7. 基因工程和结构预测基因工程技术用于构建和表达蛋白质的基因，以大规模生产蛋白质。
蛋白质合成方式
蛋白质合成方式蛋白质是构成生物体的重要组成部分，不仅参与了许多生命活动，还具有多种功能。
蛋白质的合成是维持生物体正常运转的基础，它是通过一系列复杂的生化反应进行的。
本文将详细介绍蛋白质的合成方式。
蛋白质的合成过程可以分为两个主要阶段：转录和翻译。
转录是指在细胞核内，DNA的信息被转录成RNA的过程。
首先，DNA 的双螺旋结构被解开，然后RNA聚合酶（RNA polymerase）沿着DNA的模板链合成RNA的单链。
这个过程称为转录。
转录过程中，RNA的核苷酸序列与DNA的模板链序列是互补的。
转录过程可以分为三个步骤：启动、延伸和终止。
在启动阶段，RNA聚合酶结合到DNA的启动子上，形成转录起始复合物。
然后，RNA聚合酶在DNA模板链上向下滑动，合成RNA链。
在延伸阶段，RNA聚合酶不断合成RNA链，直到到达转录终止信号。
最后，在终止阶段，RNA聚合酶与终止信号相遇，终止转录过程。
转录后的RNA被称为信使RNA（mRNA），它携带着DNA的遗传信息，将其带到细胞浆中的核糖体进行翻译。
翻译是指在核糖体中，mRNA的信息被转化成蛋白质的过程。
翻译过程需要参与的分子有：mRNA、转移RNA（tRNA）、核糖体、氨基酸等。
首先，mRNA与核糖体结合，形成翻译起始复合物。
然后，tRNA带着特定的氨基酸与mRNA上的密码子互补配对，使氨基酸逐渐连接起来，形成多肽链。
这个过程称为翻译。
翻译过程可以分为三个步骤：启动、延伸和终止。
在启动阶段，小核糖体子单位（小核糖体）结合到mRNA的起始密码子上，引导大核糖体子单位（大核糖体）结合到mRNA上，从而形成翻译起始复合物。
然后，在延伸阶段，tRNA带着氨基酸与mRNA上的密码子互补配对，核糖体不断移动，合成多肽链。
最后，在终止阶段，翻译终止子出现，导致翻译终止，释放出合成的多肽链。
蛋白质合成的过程中，还需要一些辅助因子的参与。
例如，启动因子帮助RNA聚合酶结合到DNA的启动子上，而终止因子帮助RNA聚合酶识别终止信号。
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专一性洗脱
选用与配体结合能力更大物质的洗脱液。 eg.底物配体：底物类似物、酶抑制剂等
亲和层析过程示意图
几种特殊的亲和层析
免疫亲和层析
共价亲和层析
固定化金属离子亲和层析
免疫亲和层析
是根据生物大分子的抗原决定部位与其抗体的
结合部位之间专一性相互作用进行层析的技术。 将抗体作为配体结合在层析支持物上，制成的 免疫亲和柱可特异性地纯化蛋白质。
离子交换剂的再生
类型 处理用的酸或碱浓度 浸泡时间
纤维素
Sephadex Sepharose
0.5 mol/L HCl或NaOH
（含0.5 mol/L的NaCl） 0.1 mol/L HCl或NaOH
3~4 h
0.5 h 可在柱中 再生
长时间 浸泡无影响
（含1 mol/L的NaCl）
1 mol/L NaAc (pH3.0) 或0.1 mol/L NaOH (含1 mol/L NaCl) 0.5~1 mol/L HCl或NaOH (含1 mol/L NaCl)
免疫亲和层析纯化人干扰素
单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化
重组人α 2a干扰素(rHuIFN-α2a)
1.表达rHuIFN-α2a的工程菌用盐酸胍裂解，过DEAE 凝胶柱粗提，收集活性峰。 2. rHuIFN-α2a粗提物用pH 7.2，0.15 mol/L PBS透析 过夜,上样于经pH 7.2，0.15 mol/L PBS平衡的亲和层 析柱，流速0.5ml/分,然后用大量PBS流洗至流出液 OD280≤0.02,再用pH 2.4, 0.1 mol/L甘氨酸-HC1洗脱,洗 脱液立即转至pH 7.2，0.15 mol/LPBS中透析过夜，测 定蛋白浓度、纯度和活性。 3.洗脱的rHuIFN-α2a纯度:>90％ , rHuIFN-α2a的回收 率:≥95％
共价层析
层析材料进与样品中的一个成分发生专一性共
价反应，使其保留在层析材料上。分离过程是 依靠共价键的形成和断裂来实现的。
对巯基专一型； 对甲硫氨酸专一型 对色氨酸专一型
吡啶二硫化物 N + ESH -S-S-
-S-S-E +
N
+ 巯基乙醇或半胱氨酸 2RSH
-S-H +
ESH
+
R-S-S-R
蛋白质化学
蛋白质的层析分离
根据物质在固定相和流动相中的分配系数的不
同，使分配系数只有微小差异的物质获得最大 的分离效果。
根据两相状态，分为： 气相层析和固相层析 根据层析机理，分为： 吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析
层析法的一般原理
溶质在两个互不相溶的溶剂中，它在固定相和
-NH-(CH)n-CH- CH2 -NH-(CH)n-C- CH -
选择疏水胶的原则
上柱样品中加入一定浓度的盐。盐离子可以加强溶质与
疏水胶的相互作用。一般要在比较高的离子强度下吸附 蛋白质。各种盐对疏水作用的影响如下：
疏水层析柱的洗脱
改用低浓度的盐;降低离子强度;加乙二醇。在
洗脱也中加去污剂；增加洗脱pH。
金属螯合层析
利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基
与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相 上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱 氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合 作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。
常用的离子有： Cu2+ 、 Ni2+ 、 Co2+ 、Zn2+
金属螯合层析示例
疏水层析过程示意图
亲和层析
根据特定蛋白质对某种的生物专一性来进行分
离。
如：酶与酶的抑制剂、抗原和抗体、酶蛋白和辅酶、 激素和受体、金属结合蛋白和螯和剂、凝集素和糖蛋 白有一种特殊的亲和力，在一定条件下他们可以紧密 地形成复合物。
因此，将复合物的一方固定在不溶性的载体上，
可以从溶液中专一性地分离和提纯对方。
2 N=L/H=16(Ve/W)
H:理论塔板高度 Ve: 洗脱体积 W:峰宽
D值一定的条件下,提高柱效: (1)增加柱长 (2)降低理论塔板:降低流速和支持物的颗粒度
离子交换层析
原理:根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目
的.
经化学反应将解离集团引入到惰性支持物上,通过不同
的电荷来分离分子。
标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图。
凝胶过滤层析过程示意图
疏水层析
原理：根据蛋白质分子疏水性的不同而达到蛋
白质分离的目的。在不带电的载体上偶联上疏 水基团形成疏水吸附剂，将带有非极性的生物 活性物质吸附在一起，然后改变层析条件，减 弱疏水作用，将吸附物质解离下来。
疏水吸附剂的制备
Seph-Cn -NH-(CH)n-1-CH3 n-COOH -NH-(CH)2-OH -NH-(CH)2-
解离离子带负电，
结合阳离子，称为阳离子交换柱。 带正电， 结合阴离子，称为阴离子交换柱。
注: pH在等电点处,分子的净电荷为0,无相互作用; pH在等电点以上,分子带负电,可结合于阴离子交换剂; pH低于等电点,分子带正电,可结合于阳离子交换剂.
离子交换层析
平衡:电荷量越大,结合越牢,在柱中移
习题
今有以下4种蛋白质的混合物：（1）pI=10；
（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5. 若不考 虑其它因素，当它们流过DEAE-纤维素阴离子 交换柱，用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗 脱顺序如何，并具体说明其原因。
答案:在离子交换柱上，带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质
HPLC层析仪结构示意图
溶剂槽
高压泵 样品注入器 温度控制器 分析柱 梯度装置
检测仪 分部收集器
流量检定器
记录仪
数据处理
层析一般步骤：处理介质
↓ 装柱 ↓ 平衡 ↓ 上样 ↓ 洗涤 ↓ 洗脱 ↓ 介质再生
层析条件的选择
了解样品的性质：稳定性、不同pH下的
带电情况、pH和盐浓度对活性或溶解度 的影响。 选择正确的离子交换剂。 电荷、大小 选择正确的缓冲液
合适的pH值; 不能干扰洗脱液的测定。用紫外吸收法测定蛋白质时， 不能用带苯环的缓冲离子；在215~225 nm范围测定肽 键含量时，不能用带羧基的缓冲液。 阳离子交换用阴离子型缓冲液：磷酸、醋酸等； 阴离子交换用阳离子型缓冲液：Tris-HCl等。
对特定蛋白质有亲和力的小分子配体。
如酶的底物(或底物类似物)、调节配体、效应物、酶 辅助因子等。
对特定蛋白质有亲和力的大分子。 如抗体、伴刀豆球蛋白、蛋白质类抑制剂、维生素或 激素的结合蛋白或者受体等。
共价亲和层析中的配体，含与目的蛋白质可逆
作用的部分。
亲和层析的洗脱
非专一性洗脱 改变缓冲液的离子强度或者pH或者介电系数。使吸附 的大分子的构象发生改变，以降低其与配体之间的亲 和力，将吸附的大分子从层析柱上洗脱下来。
流动相中的浓度比是一个常数，称为分配系数， 这就是分配定律：
k=
c1
c2
vs vm
或用溶质在两相中的体积表示：
D= k .
层析柱分离物质示意图
32
16
16
8 16
4 12
2 8
8
12
12
4
8
2
塔板理论
柱子的分离效率在一定条件下主要决定于 塔板数的多少,柱子的塔板数主要依赖于柱长和 理论塔板高度:
PI值的顺序为1>3>4>2。因此，在某种pH值下，所带电荷由正到 负的顺序为1>3>4>2。因此，洗脱出现的先后顺序就是1>3>4>2。
凝胶过滤层析
原理:根据分子量的大小不同而达到分离的目
的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶 孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中。其 他分子由大到小先后从凝胶中流出。
样品:
柱:
5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记
谷胱甘肽转移酶，GST-(His)6 HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+
结合缓冲液: 1X 磷酸缓冲液, 20 mM 咪唑 pH 7.4 洗脱缓冲液: 1X 磷酸缓冲液, 500 mM咪唑 pH 7.4 流速: 结果: 2 ml/min, 312 cm/h 洗脱 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 总量: 4.46 mg
合成凝胶
层析一般步骤：处理介质
↓ 装柱 ↓ 平衡 ↓ 上样 ↓ 洗涤 ↓ 洗脱 ↓ 介质再生
离子交换层析过程图
离子交换层析过程图
习题
三个氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，经过
一个sulphonoted polysturene 阳离子交换树脂 粒，用pH5的缓冲液洗脱，洗脱液中氨基酸出 现的顺序是 A．Asp,Leu,Lys; B．Leu,Asp,Lys; C．Lys,Leu,Asp; D．Leu,Lys,Asp
动速度越慢;电荷不同,亲和力不同. 洗脱:带电蛋白质分子与交换剂的结 合可逆. 通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的 蛋白质从柱上洗脱下来.
离子交换剂的基本类型
解离集团类型 DEAE QAE Q CM 名称 性质 -O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2 弱碱性 -O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3 强碱性 -CH2-N+-(CH3)3 -O-CH2-COO强碱性 弱酸性
亲和层析
配体
载体 待分离的分子 +
竞争性成分 +
+
亲和层析配体的选择
能与欲分离的分子专一性地结合，并且
有很强的亲和力；
结合后能解离，而且无损于生物大分子