蛋白质化学--一级结构测定

一 概况
1、一级结构（初级结构） 主要指多肽链中氨基酸的排列顺序，但还包 括其连接方式以及二硫键位置。 2、一级结构的分析和测定
（1）确定多肽链中氨基酸的连接方式是肽键 结构的实验依据：
a
蛋白质水解产物是氨基酸 寡肽与蛋白质均呈现双缩脲反应
NH2 C NH C O NH2 O
b
碱性 + CuSO4 紫红色 络合物
三聚体
六聚体
（2） 一级结构测定简况
英国科学家 F. Sanger等人 用了10多年时间，于1954年首次完成了 牛胰岛素一级结构（51个氨基酸残基） 的测定工作。
美国科学家 S.Moore 和 W.H.Stein等人用了5 年时间，应用Edman反应和离子交换技术， 于1960年完成了牛胰核糖核酸酶一级结构（124 个氨基酸残基）的测定工作；
（二） C-末端测定法
常用的是羧肽酶法， 其次是肼解法。
1 羧肽酶法： 蛋白质样品与羧肽酶反应，然后分析在不 同时间多肽链从C端先后所释放出来的氨基酸 种类。
常用羧肽酶生化特性表
名称 羧肽酶 A 羧肽酶 B 羧肽酶 C 来源 胰脏 胰脏 柑桔叶 水解肽键专一性 除 Arg、 Lys 、 Pro 、 Hyp 外 所有 A.A.形成的肽键 Lys、Arg 所形成的肽键 除 Hyp 外所有 A.A.形成的肽键 最适 pH 8.0 8.0 5.3 5.5 最适温度 分子量 370C 370C 300C 250C 35,300 34,300 150,000 6,100
目前，有关测定方法更加 微量化、自动化、 快速化，在1个月内就能够完成100多个氨基酸 残基组成的蛋白质一级结构测定工作。 应用质谱分析技术来分析蛋白质序列可以测定基本思路和程序
基本思路与程序： 分离纯化蛋白质， 特定位点降解多肽链， 分离小肽段 分析鉴定小肽段氨基酸序列， 排出所有小肽段氨基酸序列， 比较重叠（接头）肽氨基酸序列， 确定整个多肽链氨基酸序列。
（3）可用含水的三氟乙酸进行处理 如： 对于N-乙酰丝氨酸， N-乙酰苏氨酸， 可以在聚丙烯离心管中，加入含水三氟乙酸 （TFA），密闭，40度保温1h，然后打开管 盖子，让TFA挥发，干燥后，进行序列分析。
（2）焦谷式的N-末端 如促甲状腺释放因子、促黄体释放因子的 N-末端形成焦谷式 (谷氨酸分子内部以酰胺 键形式自我环化)：
2 异肽键结构
-----HN C O CH NH----CH2 CH2 H CH2 C H NH CO
CH2 CH2O -----HN CH C-----
（二）多肽链间的解离及分离 1 多亚基蛋白间非共价键结合的解离 若多亚基间以非共价键连接，在温和条件 下即可以拆离亚基，如改变溶液pH，将pH降 低到3～4或升高到9～10；或者加入变性剂， 如8 mol/L 尿素或6 mol/L 盐酸胍等处理，从 而打破肽链间的非共价键联结而被解离。
碱性条件下反应
O 2N NO2 O O H2N CH CNH CH C--R2 R1 O 2N NO2 N- HC R1
+
F
pH8-9
O O CNH CH C--R2
O 2N 5.7NHCl
NO 2
+
NH 2
水解 16-24 h DNP-氨基酸
NH CH COOR1
O CH C------R2
乙醚抽提后层析分析
•
肽链末端分析
通过肽链末端（N-端，或C-端）的分析，就 能够知道蛋白质分子中肽链组成的大概情况。 如： 测定胰岛素单体，发现有2个N-末端（Gly， Phe）和 2个C-末端（Asn，Ala），那么，就可 以推测胰岛素单体可能是有二条肽链内部通过 二硫键相联而组成的。
（一）游离N-末端测定
1 二硝基氟苯(DNFB)法
常 见 的 变 性 剂
十二烷基硫酸钠与十二烷基磺酸钠
两种物质都是阴离子表面活性剂，其中十二 烷基硫酸钠是常用的生化和免疫实验用试剂。
人们一般认为： 1 个分子SDS 可通过其烷基与蛋白质分子中 2 个氨基酸残基相结合
（三）氨基酸组成成分分析 为什么要求做氨基酸组成成分分析？ 如果知道了某蛋白质的分子量，再 知道了它的氨基酸组成成分及其含量， 就能够大致了解到蛋白质分子中各种氨 基酸残基的个数。
三
测定前期准备工作
（一）分离、纯化蛋白质 提取以及纯化蛋白质的工作是一件费时、 费力、很不容易的工作。
通常情况下，要求杂蛋白含量不能超过3%。
（二）蛋白质分子量和多肽链数目的确定 为什么要测定一下蛋白质分子量 ？ 蛋白质分子量如何进行测定？ • 分子量的测定 精确知道蛋白质的分子量，只有在其一 级结构完全知道以后才能达到！
（二）蛋白质分子量和多肽链数目的确定 • 分子量的测定 分子量测定方法主要有： 凝胶过滤法 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （SDS-PAGE）等（测定的误差不超过10%） 离心沉降法
• 蛋白质分子中多肽链数目的确定 如何确定？
有两种连接情况： （1）以非共价键联系的肽链 --让蛋白质变性后再分离鉴定； （2）以-S-S-连接的肽链 --加入β-巯基乙醇等还原剂后再分离鉴定
3 异硫氰酸苯酯（PITC）法 （ Phenylisothiocyanate）
碱性条件下反应
O N H2N CH C NH CH COO--R1 R2 C S
+
pH8-9
H N
R1 O NH CH C NH CH COO--R2 C S
25%三氟乙 酸水溶液 无水三氟乙 酸下裂解 （其他肽键 不断裂 ）
如： 血红蛋白经8 mol/L 脲处理后，α及β链可以 得到分离；
N
O C H R C 1 C S NH O
苯氨基硫甲酰多肽 （PTC-蛋白）
+
H2N CH C COO--R2
乙酸乙酯抽提后层析法分析
苯基乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸） （ Phenylthiohydantoin amino acid ）
以上的方法都是化学法 能否用酶法测定 ？
蛋白水解酶 ？
蛋白质水解酶的分类： Protease: Endopeptidase（ Proteinase)
OC OH CH2 CH2 CH C NH--H2N O OC CH2 CH2 CH C NH--O
NH
焦谷式（吡咯烷酮羧基）末端处理方法 采用牛肝焦谷氨酸氨肽酶方法，该酶 能够水解N-末端的吡咯烷酮羧基，水 解后可使肽用 Edman法分析。
OC
CH2 CH2 CH C NH--O
O OC CH2 CH2 CH
EDTA-----抑制金属蛋白酶类；
PMSF(苯甲基磺酰氟化物) ------抑制Ser-OH蛋白酶，也抑制部分 Cys-SH类蛋白酶
AEBSF-----抑制Ser-OH蛋白酶类 E-64 ------专一抑制 Cys-SH蛋白酶类
1，10-phenannthroline ----抑制金属蛋白酶类 Leupeptin ----同时抑制Ser-OH和Cys-SH蛋白酶 类
羧肽酶 Y 面包酵母 所有 A.A.形成的肽键
注意： 使用羧肽酶分析肽链-C末端时，一定不能 混入内肽酶，否则会造成结果混乱。
2 肼解法
反应后，用苯甲醛溶液抽提，酰肼化合物 与苯甲醛作用生成不溶物而除去，唯有末端 氨基酸化合物在水相可以用层析法鉴定。
（三） 封闭N-末端（没有游离N-末端）测定 1 N-末端封闭形式 （1）N-末端乙酰化 如人、牛、马、猪等的α-促黑激素（13肽）， 它的N-末端Ser被乙酰化：
O H3C C O NH CH C NH----H2C OH
又如兔肌红蛋白、蜂毒素的N-末端被甲酰化。
甲酰、乙酰化N-末端的处理方法
（1） 甲酰化N-末端的甲酰基可先用脱甲酰酶 或温和的酸水解除去；
（2）乙酰化N-末端的乙酰基也可用乙酰氨基 酸释放酶（Acylamino acid-releasing enzyme，AARE）处理，但请注意：该酶 不能作用长度在20个氨基酸以上的蛋白质 或肽。
H3C
CH3 N
H3C
CH3 N O
碱性条件下反应
+
O S Cl
H3C N CH3
H2N CH C R1
NH CH COO--R2
pH9.5
O S HN
盐酸水解
O O CH C NH CH COO--R2 R1
O
O
+
O S HN O O CH C OH R1
H2N CH C COO--R2
可直接点样后通过聚酰胺 薄膜层析进行分析鉴定
NH
enzyme
NH
H2N + C OH O
CH C NH---R
H2O
OC OH CH2 CH2
CH C OH H2N O
吡咯烷酮羧酸经酸水解形成后，也就可 进行谷氨酸的确证。
五 肽链的分离 （一）肽链间交联的结构 1 二硫键结构
---HN CH CH2 S O C ------
S CH2 O ---HN CH C ------
内切肽酶 外切肽酶 （蛋白酶） （肽酶）
Exopeptidase （Peptidase)
内链内切肽酶（内肽酶）中还分： Serine–类 (EC 3.4.21)
如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶
Cysteine -类
(EC
3.4.22)
如菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，无花果蛋白酶
Aspartic-类 （酸性）
肽链外切酶 （外肽酶）类型 主要有： 氨肽酶、羧肽酶、二肽酶、三肽酶 、 二肽基肽酶、三肽基肽酶等。
氨肽酶：能从多肽链的氨基端开始一个一个 地水解氨基酸残基的外肽酶 羧肽酶：能从多肽链的羧基端开始一个一个 地水解氨基酸残基的外肽酶
二肽酶： 水解二肽成为氨基酸的外肽酶 三肽酶： 水解三肽成为氨基酸的外肽酶