白血病淋巴瘤免疫分型
白血病细胞的免疫分型
白血病细胞的免疫分型正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。
因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。
白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。
由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原，这又增加了白血病免疫分型的复杂性。
近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。
国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM），此外还有免疫组化法，电镜和荧光显微镜也可以帮助诊断。
其中流式细胞术（F CM）和免疫组化法较为常用。
流式细胞术中，白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
因为FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜，浆，核的抗原表达。
另一个重要理由是至今尚未发现白血病的特异抗原。
所以能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。
这群细胞充盈于骨髓。
抗原表达与其相应系列/阶段的血细胞无明显差异。
与形态学检查相似仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性。
单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。
因此，近年来主张用设门（gating）方法。
即用CD45与侧向角（side scatter,SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原。
其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。
白血病免疫分型测定
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11 Nhomakorabea上机测样
报告结果
报告百分数
操作性能
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。
采集部位腰穿采骨髓
抗凝剂肝素抗凝
要求1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4：鞘液液体20L室温
5：清洗液液体5L室温
血液病免疫分型
血液病免疫分型血液病的免疫分型主要根据免疫表型和免疫遗传学特征进行分类。
以下是一些常见的血液病免疫分型：1. 急性淋巴细胞性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL）的免疫分型：- B-ALL：由B淋巴细胞系发展而来。
- T-ALL：由T淋巴细胞系发展而来。
2. 慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Lymphoma，CLL/SLL）的免疫分型：- CD5+/CD23+/CD20+：典型的B淋巴细胞来源。
- CD5-/CD23+/CD20+：非典型的B淋巴细胞来源。
- CD5+/CD23-/CD20+：突变的B淋巴细胞来源。
3. 急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）的免疫分型：- 标准化治疗亚组（NCCN标准化治疗亚组）：包括核准的AML-M0至AML-M7亚型。
- 非标准化治疗亚组：包括AML-M0、AML-M6和AML-M7亚型以外的亚型。
4. 慢性髓性白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）的免疫分型：- Ph染色体阳性（Ph+）：含有Ph染色体（Philadelphia染色体）。
5. 骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative Neoplasm，MPN）的免疫分型：- 慢性骨髓性白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）：Ph染色体阳性。
- 原发性骨髓纤维化（Primary Myelofibrosis，PMF）：包括JAK2V617F突变和CALR基因突变。
- 骨髓增殖性肿瘤不分类型（Myeloproliferative Neoplasm，NOS）：不符合上述分类的其他骨髓增殖性肿瘤。
这些免疫分型对于血液病的诊断、预后评估和治疗选择具有重要意义。
注意，具体的免疫分型细节可能因研究、疾病进展和新兴的治疗手段而不断改变。
白血病淋巴瘤免疫分型精品课件
Cytokinr
+
Cytokines
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DNA
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设门
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08-03307
设门
全部 细胞
门内细胞
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血液肿瘤分类进程
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白血病免疫分型的理论基础
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CD45/SS示意图
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4
抗原分布
• 表面,胞浆,核内
• 是共同检测还是分别检测?
表面
胞浆
核内
CD3, CD4, CD8, tetramer
cytokines
DNA
CD3,4,8, tetramer
+
Cytokines
CD3,4,8, tetramer
+
Promyeloid
CD15+/CD117+/-
CD34HLADR-
CD11b-, CD14-
Myelomonocytic & Monocytic
CD14+ CD4+/HLADR+ CD15+ CD11b+
红系和巨核系的鉴定需要另外增 加二线抗体。 如:CD71、GPA、CD41、CD61
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CD2-/+ CD5-/+ sCD3-
CD4CD8-
Common Thymocyte
CD2+ CD5+ Dual CD4+/CD8+ sCD3-
白血病免疫分型
正常人血液白细胞CD45-SSC设门散点图
R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：中性粒细胞 R4：嗜酸性粒细胞 R5：原始细胞
正常人骨髓有核细胞CD45-SSC设门散点图
R1：淋巴细胞 R2：粒系细胞 R3：单核细胞 R4：原始细胞 R5：幼红细胞
白血病细胞的特性
白血病细胞的异常表现在： 抗原系列异常和时间异常
CD15
CD1a
CD64
2008年WHO细胞系别确定标准
髓系：MPO（流式细胞术、免疫组化或者细胞化 学） 或单核系分化（非特异性酯酶弥漫性阳性， 或者CD11c、CD14、CD36、CD64、溶酶体， 两个及以上阳性） T系：胞浆CD3（流式使用抗CD3ε链的抗体；免 疫组化使用的多克隆抗体会检测到非T细胞特异性 的CD3ζ链） 或胞膜CD3（MPAL中比较罕见） B系：CD19强表达加下述标志中至少一个强表达： CD79a、胞浆CD22、CD10 或CD19弱表达加下述标志中至少两个强表达： CD79a、胞浆CD22、CD10
髓片
POX染色
AML-M0
AML-M1
AML-M2
AML-M3
AML-M3v
AML-M4EO
AML-M4b
AML-M5b
AML-M6
AML-M7
AML免疫分型总结
192例AML病例中免疫分型结果示髓系抗原CD13、CD33、 MPO最常见，其次CD117也是髓系比较敏感的指标，在 原始细胞百分比高的AML亚型中有较高的阳性率。
白血病免疫分型---CD45-SSC设门
CD45是白细胞的共同抗原成分,所有人类白细胞均表达CD45，包括 淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞、胸腺细胞、 脾细胞、扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞。 造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即分化 程 度 高 的 细 胞 CD45 表 达 量 高 ， 分 化 程 度 低 的 细 胞 CD45 表 达 量 低 （淋 巴细胞>单核细胞>成熟粒细胞>原幼细胞，在红细胞中不表 达。 SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞>单核细胞>原 幼 细 胞 > 淋 巴 细 胞 ） 。 目 前 ， 国 际 上 采 用 CD45—SSC 设 门 （Gating），可将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分 型的准确性。
免疫分型
2．特点 (1)近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和 航空都获得了一定程度的发展。 (2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。 (3)地域之间的发展不平衡。 3．影响 (1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式， 一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的 联系，丰富了人们的生活。 (2)消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。
[串点成面·握全局]
一、近代交通业发展的原因、特点及影响 1．原因 (1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促 进中国社会发展。 (2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压 中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。 (3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供 了物质条件。
急性白血病是由于白血病细胞生成紊 乱而导致，白血病细胞在癌变过程中， 丧失了正常细胞的系列专一性和分化 阶段规律性，在本质上有别于正常骨 髓细胞。
故白血病细胞往往停滞在细胞分化的某一抗原表 达阶段
应用此特点可进行免疫表型分析，以鉴别各种白血 病和淋巴瘤，辅助临床诊断、评估疗效和预后。
免疫分型的作用
细胞系列抗原的表达 ---B细胞系抗原
B细胞根据发育阶段可分为： B祖细胞 TdT、CD34、HLA-DR
前B细胞（可再分为前前B、前B）TdT、CD34、CD10、CD19、CD24
未成熟B细胞 CD19、CD24、CD20、CyCD22
成熟B细胞 CD19、CD24、CD20、CyCD22
二、水运与航空
1．水运 (1)1872年,
轮船正招式成商立局，标志着中国新式航运业的诞生。
(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是
在列强排挤中艰难求生。
我国急性白血病免疫分型的四色方案
我国急性⽩⾎病免疫分型的四⾊⽅案中国流式细胞术急性⽩⾎病免疫分型四⾊⽅案由于多参数流式细胞术(MFC)免疫分型具有客观、敏感、准确等特点，免疫表型已成为诊断急性⽩⾎病的重要依据之⼀。
因准确的诊断需要选择⼀定数量的抗体，涉及多个造⾎系列的抗原。
但⽬前国内甚⾄国际上没有规范化的⽅案可以借鉴。
⽽国内不同的医疗单位所⽤的抗体数量和种类均有较⼤的异质性，有些单位由于应⽤的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会⾎液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次的讨论，提出以CD45/SSC为基础的中国流式细胞术急性⽩⾎病免疫分型四⾊⽅案，供参考。
本⽅案不包括标本的采集、保存、制备、试剂和仪器的调整及急性⽩⾎病的诊断标准，这些对免疫分型同样重要，可参考相应的指南。
1．适应范围：1.1急性淋巴细胞⽩⾎病(ALL):z B系：早B前体-ALL(Pro-B), 普通-B-ALL(Common-B),前体B-ALL(Pre-B),及与Burkitt淋巴瘤进⾏鉴别z T系：早T前体-ALL (Pro-T), 前体T-ALL(Pre-T),⽪质-T-ALL和髓质-T-ALL.1.2急性早幼粒细胞⽩⾎病（APL）1.3急性髓细胞⽩⾎病（AML）z AML微分化型（AML-M0）z AML伴粒系和单核细胞分化型（AML-M1/2和AML-M4/5）z急性红⽩⾎病（AML-M6）z急性巨核细胞⽩⾎病（AML-M7）1.4前体树突细胞肿瘤1.5急性嗜碱性粒细胞和肥⼤细胞⽩⾎病1.6 混合表型⽩⾎病1.7 对上诉急性⽩⾎病治疗后检测MRD的标志进⾏筛查2.抗体的选择：根据检测的⽬的，需要检测不同的抗体：2.1 鉴别急性、慢性⽩⾎病:对于急性髓细胞⽩⾎病，可以根据CD45/SSC图型进⾏初步判断。
髓系⽩⾎病细胞CD45的表达较弱，往往位于正常淋巴细胞下⽅，且多数⽩⾎病细胞SSC较低（除去⼤颗粒APL 患者）。
急性淋巴细胞白血病流式免疫分型探讨
在现实社会中，注意问题比文化素质低更为严重，ADHD大约有50%~80%病例可一直持续到青春期，有30%~50%ADHD病例可持续到成人期，因此，人们认识到ADHD不仅仅是一种儿童障碍，也是一种成人障碍，它可以使人致残。
从临床表现分析，ADHD在儿童期表现为以多动常见，而在青少年期表现为叛逆性常见。
在成人期多动行为可能减少而注意力问题表现更为突出。
注意缺陷会造成学习困难，将直接影响成年后的就业问题。
ADHD如不治疗，可持续到成人期，其后果十分严重，可发展为人格障碍，其表现为冲动、反社会行为、偷窃行为、说谎行为、物质滥用等成瘾行为危害性更大，而治疗十分困难，它将给家族和社会带来极大的危害性，必须引起精神卫生工作者的重视。
因而必须及早对儿童进行矫正治疗，培养儿童健全的人格，使他们成为国家建设的合格人材。
参考文献1王惠梅，张惠清，梁英仪，等.太原市儿童注意多动障碍流行病学调查.中国心理卫生杂志，1997，11（1）：472汪向东，王希林，马弘.心理卫生评定量表手册.北京：中国心理卫生杂志社，1999.553张静萍，于爱萍.合肥市6~11岁儿童多动症患病情况调查.预防医学文献信息，2000，6（4）：3094李元真，景梅菊，赵东霞，等.山西省6~12岁小学生“儿童多动症”患病率调查.中华心身医学杂志，2002，2（2）：905王丽敏，应长青，李德安，等.哈尔滨动力区7~10岁儿童多动症流行病学调查.中国行为医学科学，1997，6（4）：284（收稿日期：2002-09-06）急性淋巴细胞白血病流式免疫分型探讨吴铭孙雄飞陈晓琳暨南大学医学院第二附属医院，广东省深圳市人民医院血液科（518020）【摘要】目的对28例急性淋巴细胞白血病（ALL）进行流式免疫分型研究，探讨CD19，CyCD79a，CD7，CyCD3等白细胞分化抗原在急性淋巴细胞白血病临床免疫分型中的意义。
方法应用双色流式细胞术，对28例经细胞形态学、细胞组织化学和临床表现确诊的急性淋巴细胞白血病患者初诊骨髓或静脉血标本进行免疫分型，采用CD45/SSC设门，MPO以阳性细胞数!3%为该表型表达阳性，其他白细胞分化抗原以阳性细胞数!20%为该表型表达阳性。
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前向角散射光（, ）
入射激光的前向散射光信号
细胞相对大小及其表面积
侧向角散射光（, ）
入射激光90 角的散射光信号
细胞粒度及细胞内相对复杂性
荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞 抗原结合越多，产生的荧光信号越强。
3
45示意图
4
抗原分布
• 表面,胞浆,核内
• 是共同检测还是分别检测?
表面
胞浆
核内
CD3, CD4, CD8, tetramer
10
细胞类型鉴定
(1993) 100:534-40.
11
(1993) 667:265-280
45示意图
正常骨髓细胞
血液肿瘤细胞
老化粒细胞 、噬酸细胞
早幼—成熟粒细胞
单核细胞 M5
M3、 M4、
淋巴细胞
、、
正常前体细胞 嗜碱性粒细胞
M2、
M0、M1、 M4、M5、
成熟红细胞、血小板
M6、M7、
细胞碎片
CD7+ and/orCD2+
Myeloid Lineage
T-Lineage
CD19+
B-Lineage
Myeloid, no or minimal
maturation
CD34+/CD117+/-
HLADR+
CD56+
CD15-/+ CD11b-, CD14-
Promyeloid
CD15+/CD117+/-
30
31
流式免疫表型诊断血液肿瘤的劣势
1、纤维化、硬化的骨髓可能没有足够的细胞分析。 2、细胞太多聚集或成团也可能没有足够的分析细
胞。 3、硬化的组织也很难得到足够的分析细胞。 4、组织结构关系、形态关系丢失。 5、比例太低的单克隆B细胞很难检测到。
32
流式免疫表型诊断血液肿瘤的劣势
6、没有异常免疫表型的T细胞淋巴瘤也可能很难检测。 7、异常的T细胞免疫表型不一定提示T细胞肿瘤，也可能
D14-
Myelomonocytic & Monocytic
CD14+ CD4+/HLADR+ CD15+ CD11b+
红系和巨核系的鉴定需要另外增 加二线抗体。 如71、、41、61
22
3 23
4
24
4
25
初治急淋分型
Acute Leukemia – Blasts Present >20%
29
多发性骨髓瘤（）
多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病。正 常浆细胞为3845，使用 3845双标记检测外周 血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常 使用38和45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤 细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记 为1956-，而多发性骨髓瘤细胞通常为1956+。 138目前认为是浆细胞最特异的指标。这样， 使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参 数分析，并计算异常浆细胞含量，对于多发性 骨髓瘤的诊断和治疗评估具有重要意义。
19
非肿瘤粒细胞、 单核细胞表型
20
白血病免疫分型
• 根据白血病细胞表达的系列相关抗原， 确定其系列来源。如：淋系、粒单系、 红系、巨核系等。
• 根据白血病细胞表达的系列分化其相关 抗原进一步分型。如：早前B，前B，普 通B…
21
初治急白分型
– >20%
CD13+ and/orCD117+ and/orCD33+
非血液来源1细2 胞
B淋巴细胞分化与抗原表达关系图
(2006) ’s
13
T淋巴细胞分化与抗原表达关系图
(2006) ’s
14
粒细胞分化与抗原表达关系图
(2006) ’s
15
单核细胞分化与抗原表达关系图
(2006) ’s
16
非肿瘤T淋巴 细胞表型
17
非肿瘤B淋巴 细胞表型
18
非肿瘤粒细胞、 单核细胞表型
CD7+ and/or CD2+
CD19+
T-Lineage
B-Lineage
2 5 348-
2+
2+
5+
5+
48+
4+ 8+
3-
3+
B
10+
10-
10+
10
26
27
28
白血病免疫分型的价值
确定的细胞类型（B细胞或T细胞）和 的分化阶段。 鉴定的特征。 对形态学上未分化的急性白血病有助于鉴 定细胞类型。 诊断一些少见类型的白血病。如：M6、M7、 M0等。
cytokines
DNA
3,4,8, +
3,4,8, +
+
3,4,8, +
+
5
设门
6
08-03307
设门
全部 细胞
门内细胞
7
08-03307
8
血液肿瘤分类进程
9
白血病免疫分型的理论基础
白血病/淋巴瘤免疫分型采用的抗原标 志是表达于正常造血细胞不同分化发育阶 段的分化抗原。虽然是恶性肿瘤细胞，但 仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而 仍可依据其抗原的表达谱对白血病/淋巴瘤 进行免疫分型。为了正确分析白血病/淋巴 瘤细胞，必须对正常造血细胞分化抗原的 表达模式有充分的了解。只有熟悉正常细 胞的抗原表达模式，才能辨认白血病/淋巴 瘤细胞的存在。
是感染引起的单核细胞增多症、反应性皮肤病、炎症性 疾病。 8、取材不好或样品保存不当，可能导致假阴性的结果。 9、的肿瘤细胞水平低，所以免疫表型检测或诊断不可靠。 10、治疗或复发可能引起肿瘤细胞表面抗原改变。
33
谢谢！
白血病淋巴瘤免疫分型
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（ , 简称）是一种可以快速、准确、 客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的 多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并 加以定量
2
散射光信号和荧光信号