甲基对硫磷水解酶酶活测定方法

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酶活测定方法

、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。

在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。

通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。

色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。

该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。

粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。

木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。

基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。

这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。

免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。

用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。

在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测作者：白俊岩高熳熳孙磊程书梅霍书英来源：《江苏农业科学》2020年第04期摘要：甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药，常被用作菜农用作杀虫剂，有机磷水解酶可通过切断甲基对硫磷中的PO键实现对甲基对硫磷的快速、高效降解。

通过对有机磷水解酶降解条件进行优化，得到有机磷水解酶最优的农药降解条件：酶浓度为1 ∶1 000、pH值为8、降解温度为37 ℃、降解时间为10 min。

通过气相色谱法测得有机磷水解酶对1、5、10μg/mL甲基对硫磷的降解率均达到98%以上，因此在生产中有机磷水解酶可作为针对甲基对硫磷的高效快速降解酶进行推广使用。

关键词：甲基对硫磷;有机磷水解酶;对硝基酚;快速降解;农药残留中图分类号： S481+.8;X592文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）04-0186-06收稿日期：2018-12-16基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFF0202302-03）。

作者简介：白俊岩（1994—），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向为食品工程。

E-mail：1129901984@。

通信作者：霍书英，博士，副教授，从事农药残留和生殖内分泌研究。

E-mail：huoshuying@。

我国是一个传统的农业大国，农药的使用量一直居于世界首位，每年达80万～100万t[1]。

为减轻病害虫对农产品的影响，滥用农药的现象经常发生。

由于农药残留检测方法受限，管理监察力度不够，高毒农药的生产以及使用情况时有发生，造成水果蔬菜等农产品质量下降，农药残留量超标，严重危害人类的健康[2]。

甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药，虽然已被国家禁用，但总有菜农偷偷用来作高效杀虫剂，有机磷农药的广泛使用在提高农产品质量和产出的同时也存在食品安全隐患[3]。

因此，严格进行食用蔬菜有机磷农药残留的检测和控制，对于保证蔬菜品质、维护人类健康、减少土壤污染和保护环境非常重要。

茶叶中甲基对硫磷的检测

中图分类号：０６５７文献标志码：Ａ文章编号：１００８ — １０３８（２０１５）０８ — ００２４ — ０４
ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｅｔｈｙｌＰａｒａｔｈｉｏｎｉｎＴｅａ
２４
２０１Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．８
中国果菜
质量控制
茶叶中甲基对硫磷的检测
刘超李英
（乐山市食品药品检验检测中心，￣！ｌＪｓＩ乐山６１４０００）
摘
要：本文采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法对绿茶、红茶、普洱茶、鸟龙茶中甲基对硫磷进行检测。建立了以Ｉｎｅｒｔｓｉｌ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｗｅｔｅｓｔｅｄｍｅｔｈｙｌｐａｒａｔｈｉｏｎｉｎｇｒｅｅｎｔｅａ，ｂｌａｃｋｔｅａ，Ｐｕｅｒｔｅａ，ｏｏｌｏｎｇｔｅａｗｉｔｈＬＣ—ＭＳ／ＭＳｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂａｓｅｄｏｎｎｏｖｅｌＨＰＬＣｃｏｌｕｍｎＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ－３ｗｉｔｈｍｅｔｈａｎｏｌａｎｄＯ．１％ａｃｅｔｉｃａｃｉｄａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ，ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＭＳ，ｗｈｉｃｈｕｓｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｉｏｎｓｃａｎｎｉｎｇ，ａｎｄｑｕａｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎｉｏｎｐａｉｒｗａｓ２６４．０／１２５．０．Ａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｎ０－２．０ｎｇ／ｍＬｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓ０．４７ｎｇ／ｋｇ．Ｔｈｅａｄｄｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ８３．５％－１０６－３％．Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｍｅｔｈｙｌｐａｒａｔｈｉｏｎｒｅｓｉｄｕｅｓａｎａｌｙｓｉｓｉｎｇｒｅｅｎｔｅａ，ｂｌａｃｋｔｅａ，Ｐｕｅｒｔｅａ，ｏｏｌｏｎｇｔｅａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｅａ；ｍｅｔｈｙｌｐａｒａｔｈｉｏｎ；ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测【摘要】本文研究了有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测。

在引言中，介绍了研究背景、研究意义和研究目的。

正文部分解析了有机磷水解酶的作用机制、甲基对硫磷的特性以及有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解过程。

同时建立了检测方法，并展示了实验结果与分析。

结论部分讨论了有机磷水解酶在降解甲基对硫磷中的潜在应用，强调了研究的创新性和意义，同时展望了未来研究的方向。

该研究为有机磷水解酶在农业和环境保护中的应用提供了重要理论基础和实践指导。

【关键词】关键词：有机磷水解酶、甲基对硫磷、快速降解、检测方法、实验结果、潜在应用、创新性、未来研究。

1. 引言1.1 研究背景有机磷水解酶是一类具有很强水解能力的酶，能够迅速降解有机磷农药等化合物。

甲基对硫磷是一种常用的有机磷农药，具有较强的杀虫效果，但由于其毒性大、残留时间长等问题，对环境和人体健康造成了严重威胁。

寻找一种快速有效的降解方法对甲基对硫磷进行处理具有重要意义。

目前研究表明，有机磷水解酶对甲基对硫磷具有较强的降解能力，可以迅速将其水解为无毒或低毒的化合物。

这为寻找一种绿色、高效的农药残留处理方法提供了新思路。

本研究旨在探究有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解机制，建立相应的检测方法，并深入分析其实验结果，为有机磷农药的生态安全和环境保护提供科学依据。

通过本研究，我们希望为有机磷水解酶在降解甲基对硫磷中的应用提供新思路，探索其在农业生产中的潜在价值，并为相关领域的进一步研究提供参考与借鉴。

1.2 研究意义有机磷水解酶是一类重要的酶类，在环境和生态方面具有重要的应用价值。

研究甲基对硫磷的快速降解及检测，不仅可以为环境中的有机磷农药的降解提供新的思路和方法，也可以为农业生产提供更有效的防治措施。

通过研究有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解机制，可以更深入地了解有机磷水解酶的作用方式，为其在环境修复、废水处理等领域的应用提供理论支持。

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测有机磷化合物是一类广泛存在于环境中的化合物，其具有高毒性、易蓄积和难降解的特点，对生物和生态环境造成了严重的威胁。

甲基对硫磷（MPTP）是一种有机磷杀虫剂，被广泛应用于农业领域。

为了对MPTP进行快速降解和检测，研究人员发现了一种有效的酶类分子-有机磷水解酶。

有机磷水解酶是一类能够水解有机磷化合物的酶类分子，包括酯酶、醋酸酯酶和胆碱酯酶等。

这些酶类分子能够通过催化水解反应将有机磷化合物分解为无害的代谢产物，从而实现对有机磷化合物的降解。

研究发现，有机磷水解酶对MPTP具有较高的催化活性和特异性，能够快速将其降解为无害的代谢产物。

为了实现对MPTP的快速降解和检测，研究人员开展了一系列的实验。

研究人员从自然界中分离得到了一株具有较高有机磷水解酶活性的细菌。

通过对其基因组进行测序分析，研究人员找到了编码有机磷水解酶的基因序列，并进一步确定了有机磷水解酶的结构和功能。

接下来，研究人员利用基因工程技术将有机磷水解酶基因插入到表达载体中，并将其转化到大肠杆菌中。

通过对大肠杆菌进行诱导表达，研究人员成功地生产了大量具有高有机磷水解酶活性的重组蛋白。

这些重组蛋白能够有效地催化MPTP的水解反应，将其降解为无害的代谢产物。

为了检测MPTP的降解效果，研究人员开发了一种基于有机磷水解酶的检测方法。

该方法利用了MPTP与有机磷水解酶的特异性反应，通过测量反应产物的浓度来评估MPTP的含量。

该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，可以用于对环境中的MPTP进行快速、准确的检测。

有机磷水解酶对MPTP的快速降解和检测具有重要的应用价值。

这项研究为解决有机磷化合物的环境污染问题提供了新的思路和方法，并为相关领域的研究提供了参考。

目前该技术仍存在一些挑战和局限性，如酶的稳定性、催化活性等方面需要进一步优化。

相信随着研究的深入，有机磷水解酶将能够在环境保护和农业生产中发挥更重要的作用。

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测在农业生产中，为了保护作物免受害虫和病原微生物的侵害，农民常常会使用农药来进行防治。

农药残留问题一直是人们所关注的一个环境和食品安全难题。

甲基对硫磷是一种常用的有机磷农药，其对人体健康和环境都存在一定的危害。

研究如何对甲基对硫磷进行快速降解和检测具有重要的意义。

有机磷水解酶是一类能够降解有机磷化合物的酶，在农业生产中具有广泛的应用前景。

有机磷水解酶通过催化水解反应将有机磷农药降解成无毒的物质，从而达到减少农药残留的目的。

有机磷水解酶还可以用于甲基对硫磷的快速检测，为农民提供及时、准确的农药残留信息，帮助他们科学合理地使用农药，保障农产品的安全。

近年来，科学家们对有机磷水解酶在甲基对硫磷降解和检测方面进行了深入研究，并取得了一系列重要的研究成果。

下面将重点介绍有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解和检测方面的研究进展。

首先是有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解。

有机磷水解酶能够与甲基对硫磷迅速结合，在其作用下，甲基对硫磷分子中的磷-硫键被水分子打开，从而降解成对人体无害的无毒物质，释放出能量。

研究发现，有机磷水解酶在中性至碱性条件下对甲基对硫磷具有较高的降解效率，同时该过程还会产生一定量的亚甲基对硫代磷酸酯、对硫磷酸酯和甲硫磷酸等降解产物。

有机磷水解酶还能够通过对甲基对硫磷分子表面的作用，使其在真菌和细菌的作用下更容易分解，从而进一步加快甲基对硫磷的降解速度。

有机磷水解酶还可以与纳米材料结合，构建高灵敏、高稳定的甲基对硫磷检测体系。

研究人员制备了一种新型的有机磷水解酶纳米复合物，在其作用下，甲基对硫磷分子能够更快速地被降解，并在纳米材料表面形成特定的光谱信号。

该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等特点，可以实现对甲基对硫磷的快速检测，为农产品质量安全提供了一种新的检测手段。

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测有机磷化合物是一类重要的农药和化工原料，在农业生产和工业生产中广泛使用。

有机磷化合物的大量使用也给环境和人类健康造成了严重的威胁。

甲基对硫磷是一种常见的有机磷农药，它具有较强的杀虫效果，但也具有一定的毒性，对人体和环境造成危害。

对甲基对硫磷的快速降解和检测具有重要的意义。

有机磷水解酶是一类能够催化有机磷化合物水解的酶类，它在有机磷化合物的降解和检测中具有重要的应用价值。

有机磷水解酶能够有效降解有机磷化合物，将其转化为无毒的产物，从而减少对环境和人体的危害。

研究有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测具有重要的意义。

有机磷水解酶可以通过催化甲基对硫磷的水解，将其转化为无毒的产物，从而降低其毒性。

有机磷水解酶是一种在自然界广泛存在的酶类，具有较强的催化活性和稳定性，能够在较宽的温度和PH范围内发挥作用。

利用有机磷水解酶对甲基对硫磷进行水解处理，可以有效地降解甲基对硫磷，降低其毒性，保护环境和人体健康。

有机磷水解酶可以通过对甲基对硫磷的水解产物进行检测，实现对甲基对硫磷的快速检测。

有机磷水解酶具有特异性较强的催化活性，可以将甲基对硫磷水解为特定的产物，这些产物在水解过程中会发生明显的变化，可以通过色谱、光谱等分析方法进行检测，从而实现对甲基对硫磷的快速检测。

研究有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测具有重要的意义。

通过对有机磷水解酶的应用研究，可以实现对甲基对硫磷的高效降解和快速检测，从而保护环境和人体健康，促进农业生产和工业生产的可持续发展。

希望通过本文的介绍和讨论，能够引起更多科研人员对有机磷水解酶的研究和应用的关注，推动有机磷水解酶在农业生产和工业生产中的广泛应用。

甲基对硫磷水解酶的随机突变和分子对接模拟

菌及降解酶提供科学依据。
收稿日期：２１—９１０１０ —３
基金项目：国家自然科学基金项目（０７６０和广东省博士启动基金项目（４１６２１０６９３８１６）９５０４００３７）李亚楠，硕士研究生．研究方向：天然源农药和农药残留降解．－ｉｒｉｙ１８１＠１３ｃｒＥｍａ：ａｌ９６０６．ｏｌｎｎｎ
材料与方法
供试ｍｐ — 的ＤＨＳｄＴａ甘油菌菌株由笔者所在
食叶害虫＿。近年来，死蜱已成为高毒有机磷杀１１供试菌株１］毒．在许多国家和地区的土壤、气、水、下水等环实验室构建并于一８大雨地Ｏ℃保存备用。
甲基对硫磷水解酶的随机突变和分子对接模拟
李亚楠张彦博胡美英陈少华胡振易欣林惠花
华南农业大学昆虫毒理研究室／天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广州５０４１６２摘要甲基对硫磷水解酶（Ｈ）ＭＰ能高效降解甲基对硫磷，并能够降解杀螟松、乙基对硫磷和毒死蜱，但降
毒死蜱是一种广谱性的中等毒性杀虫剂，长期１以来已广泛应用于防治棉田、田、稻牧场和蔬菜上的
虫剂的替代品种，是全球应用最广泛的杀虫剂之一，境中均能检测到其残留Ｉ］２。｛甲基对硫磷水解酶（ｔｙｐｒｔｉｎｈｄｏ— ｍｅｈｌａａｈｏｙｒｌ
解效率依次降低。为提高ＭＰＨ对毒死蜱的降解活性，用易错ＰＲ的方法对ＭＰ进行随机突变，选到采ＣＨ筛

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甲基对硫磷水解酶（OPHC2）的酶活测定方法：
参照Mulbry的方法（Mulbry et al., 1989），并进行了改进。

取100µL酶液加入含有5µL 10 mg/mL甲基对硫磷和900µL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液的体系中，37°C保温10 min,加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入1 mL 10% Na2CO3溶液显色，410 nm测定光吸收值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。

一个酶活性单位（U)定义为：在37°C,每min释放出1 µmol对硝基酚所需的酶量。

比活性的测定：
(1)蛋白浓度的测定
用10mg/mL贮存液（100 mg牛血清白蛋白，溶于10mL蒸溜水）按下述方法配制不同浓度的标准蛋白液：
100 µL贮存液+ 900µL蒸馏水=1000 µg/ml
80µL贮存液+ 920µL蒸馏水= 800µg/ml
60 µL贮存液+ 940µL蒸馏水= 600µg/ml
40µL贮存液+ 960µL蒸馏水= 400µg/ml
20µL贮存液+ 980µL蒸馏水= 200µg/ml
10µL贮存液+ 990µL蒸馏水= 100µg/ml
将不同浓度的标准蛋白液分别加入5ml稀释后的染料(将染料浓缩液用蒸馏水进行1 ：4稀释)，并充分混勾，在室温条件下反应30 min。

在595 nm测定标准品的光密度吸收值。

以吸光值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，做出标准品浓度与光吸收值曲线。

应用BioRad Protein Assay Kit (BioRad,USA)来测定蛋白浓度。

将蛋白染料：蒸馏水以4 ：1比例混合，取60 μ L待测酶液加入到3mL上述混合溶液中，准确反应30min，595nm读数，将所获得的数据代入到蛋白标准曲线中计算蛋白质的浓度。

(2)比活性的测定
将待测酶液加入5 ml稀释后的染料，充分混匀，在室温条件下反应30 min，在595 nm测定光密度吸收值（待测酶液的OD值必须位于标准品OD值范围之内。

如果它的光密度吸收值高于或低于标准品的吸收值，则酶液应进一步稀释，并重新进行测定。

样品的稀释倍数在计算其蛋白质浓度时必须考虑在内），在标准曲线上查出酶液的浓度（mg/mL)。

酶比活性（U/mg)=酶活性/蛋白浓度。

一个酶活性单位（U)定义为：在37°C，每分钟释放出l µmol对硝基酚所需的酶量。

比活的定义为：每分钟每毫克酶蛋白在37°C下转化的底物的微摩尔数（µM)。

有机磷降解酶酶活单位计算公式：
其中，3×10-3：反应总体积；N：酶液的稀释倍数；10①:100µL稀释酶液中的酶活性折算为1mL的酶活性；10②：反应时间。