培养基及配制

No MS salts 没有任何生长特征
MS salts 0.47 g. l-1 长出更多的根
MS salts 9.52 g. l-1
长大量的再生苗而 无根
**
愈伤组织缺无机营养表现症状
N----某些愈伤组织出现花青甙，没有导管形成
N、P或K----细胞过度增大且形成层减少
S----愈伤组织非常明显褪绿
Fe----细胞分裂停止
B----细胞分裂和细胞伸长迟缓
Mg和Mn----影响细胞伸长
2.1维生素 2.2 肌 醇
2 有 机 物
2.3天然复合物
2.4 氨基酸
2.1 维
Hale Waihona Puke 生素种类： 硫胺素---维生素B1 VB1 吡哆素---维生素B6 VB6 烟 酸---维生素B3 Vpp 抗坏血酸---维生素C Vc 以及B5、生物素、叶酸。 浓度：0.1－1.0mg/L 作用： VB1 VB6 Vpp Vc 促愈伤组织产生，提高活力 促根生长 与代谢和胚发育有关 防组织褐变
（4）母液配制的药品与器材
1）药品：配制MS培养基所需的药品、生长调节物 质、蒸馏水、1mol/L的NaOH，1mol/L的HCl 2）器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、 母液瓶、标签、冰箱等。
（5）母液配制（以MS培养基为例）
无机大量 母液 有机物母液
激素母液
无机微量母液
铁盐母液
配制MS培养基时母液的计算
4.2 细胞分裂素（CTK）
（1）种类：Kt---激动素
BAP---苄氨基嘌呤 2－iP---异戊烯腺嘌呤 ZT-玉米素 TDZ
（2）作用：启动脱分化、细胞增殖，诱导愈伤组织芽
分化、芽增殖，丛生芽。
（3）浓度：0.05－10.0mg/L （4）配制：溶于稀酸或稀碱
激素配比模式
生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈伤 组织、长根还是长芽。
一、培养基
成分
配制 技术
培养基
种类
1 无机盐 培 养 基 的 成 分 2 有机物 3 碳源和能源 4 植物激素 5 琼脂
6 辅助物质
1 无 机 盐
元素名称 N 大量 P 元素 K (≥0.5mmol/L) Ca Mg S Fe 微量 B 元素 Mn (≤ 0.5mmol/L) Cu Mo Cl 添加形式 KNO3, NH4NO3 KH2PO4 NaH2PO4 KCl KNO3 CaCl2 · 2H2O Mg2SO4 ·7H2O FeNa2-EDTA H3BO3 MnSO4 CuSO4 Na2MoO4 ·2H2O CaCl2 · 2H2O
• pH值对不同植物的影响会有差异，如玉米胚乳愈 伤组织在pH值7.0时鲜重增加最快，在pH值6.1时 干重增长最快。
不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表)
种类
杜鹃
越桔 蚕豆 番茄
最适pH值
种类
最适pH值
4.0
4.5 5.5 5.7
月季
胡萝卜、石刁柏 桃
5.8
6.0 7.0
二、 培养基的制备
天然复合物
水解酪(乳)蛋白：
浓度100-200mg/L， 多用于微茎尖培养。
马铃薯提取液： 对pH值缓冲大，用量 150-200g/L，使苗壮。
其它：
2.4 氨基酸
种类：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙
氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）
和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋
2）微量元素 在微量元素中，铁的使用最大，铁 是一些氧化酶的组成成分。同时又是叶 绿素形成的必要条件。 由于培养基的pH较高，所以培养中 几乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸铁 这种鳌合物来防止铁的沉淀。
• 硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关 系； • 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根 的生长； • 锰参与植物的光合、呼吸代谢； • 钼参与氮素的代谢； • 氯是光合作用水光解的活化剂。 • 微量元素的主要作用是作为酶的辅助 因子或激活剂参与代谢的调节。
1 水和药品
• 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过 程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少 的物质。 • 配制培养基母液时要用蒸馏水或重蒸馏水，以保 持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发 霉变质。 • 大规模生产时可用自来水。 • 但研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不 良效果。
6.4 其它成分： AgNO3 ： • 作用：吸附乙烯，促进茎芽分化，防玻璃 化苗、早衰、落叶；只能短期培养， • 用量 1~10mg/L，需过滤灭菌
pH值
• 在灭菌之前培养基的pH值一般都是调节到5.0-6.0。
• 一般来说，当pH值高于6.0时培养基将会变硬；
• 低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
白）等。 注意：氨基酸类物质只有在含有无机氮的情况 下，对离体组织生长才有较好的效果。
1 无机盐 培 第养 一基 节的 成 分 2 有机物 3 碳源和能源 4 植物激素 5 琼脂
6 辅助物质
3 碳源和能源
作用： 作为离体组织赖以生长的碳源 使培养基维持一定的渗透压（一般在1.5-4.1MPa） •种类：蔗糖或葡萄糖、果糖、砂糖等。 •蔗糖浓度：1-5%，胚培养为4-15%。 注意： •高压灭菌部分糖会分解。 •大生产时可用白砂糖。
不凝原因：①pH<5不凝；②长时间高压灭菌； ③长期存放，易变质；④厂家不同，杂质含量不同 ⑤配制时融解不充分，分装不均匀；
5.2.其它
玻璃纤维 滤纸桥 海绵、卡拉胶等
6 辅 助 性 物 质
6.1 活性炭 6.2 抗氧化物 6.3 抗生素
6.1 活性炭
1)作用：具吸附作用； • 茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1 -0.2%）； • 促进生根,根避光生长； • 防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）； • 有利于胚胎培养。 2)常用浓度：0.5－10g/L 3)注意：活性炭具副作用。选择 吸附性差，导致营养损耗和 pH↓， 应适当调高营养物质与激素水平， 并加大Agar用量。
有机物和激素类等。其中维生素、氨基酸类可以分别
配制，也可以混在一起 配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和SO42-， Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，一定 要充分溶解再放入母液中。 各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。 母液配好后放冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。
成分
称量工具
万分电子天平
C 铁盐（扩大100倍1000ml）
铁盐
硫酸亚铁， Na2-EDTA
注意：铁盐选用硫酸亚铁而不用硫酸铁，是因为它 溶解后易产生红色的氢氧化铁沉淀。
在装有800ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒氢氧化钠。溶解后 加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢 慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至 1000ml，置于冰箱中备用。
4.3 赤霉素（GAs）
（1）种类：GA3
（2）作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打 破休眠；一般在器官形成后加入。 • 注意：不耐热；生理活性5－15d，时间太长 有抑制作用。 • 较生长素和细胞分裂素少用，可溶于水。
ABA →因物种不同，能促进或抑制愈伤组织生长；
5 琼脂/培养体支持材料
5.1.琼脂 (1)用量 6－10g/L (2)种类 琼脂粉 琼脂条 (3)作用 固化作用 注意：琼脂使用有优缺点；新买应试凝固力。
药品：
• 应选取等级较高的化学纯（CP）或分析纯 (AR)； • 药品的称量一定要准确、正确，防止药勺 之间的交叉污染。
2 培养基母液的配制和保存
2.1 母液（贮备液，stock solution)配制的目的
1）方便配置其他培养基； 2）保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取 3）便于低温保藏。
NAA 0.1 mg. Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation
l-1
NAA 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus
生长素 细胞分裂素
高：有利于根的形成和愈伤组织的形成； = 适中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成
如：为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素 的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比 例。
细胞 分裂 素与 生长 素对 器官 或愈 伤组 织的 影响
No BAP
Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant
BAP 0.1 mg. l-1
More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant
No NAA Poor shoot development and no roots
6.2 抗生素
作用：抑制内生菌； 种类：青霉素、链霉素、庆大霉素、利福平、 卡那霉素等， 用量：用量5~20mg/L 注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使 用要慎重。
多数需过滤灭菌。
6.3 抗氧化物
1)常用抗氧化剂：半胱氨酸、VC 2)用量：50－200mg/L， 3)作用：防止氧化 4)注意：可用抗氧化剂洗 涤外植体伤口表面。