蛋白质双向电泳实验(1)
蛋白双向(2-D)电泳实验服务
双向电泳是目前为止最有效、使用最多的蛋白分离方法。差异蛋白质组学是在双向电泳后用考麻斯亮蓝、银离子或荧光染料等将蛋白斑点染色，然后比较差异。本公司在各类微生物、培养细胞、动植物组织（如动物软硬组织、体液、植物种子、叶子等）、亚细胞组分的双向电泳分离及后续质谱鉴定中均有丰富的经验。
一、蛋白质组学双向电泳技术服务项目：
1.根据客户需求定制蛋白质组学实验方案
2.各种规格胶条长度的双向电泳
3.考麻斯亮蓝染色、银离子染色；
4.DIGE系统双向电泳。
5.图像分析
6.切胶质谱分析
二、说明
1.蛋白质组学实验的总体实验流程；
双向电泳结果提交
A：实验的试剂耗材、仪器设备、操作过程一份；
B:实验结果凝胶扫描图片；
C：电泳凝胶（可收费干胶）；
D：剩余样本。
说明：
1.样品制备指可用通常程序处理的原样，如样品较特殊（需要去除核酸、盐等杂质或需要浓缩），价格将视进一步处理的难度和耗材用量另行商定；
2.建议客户提供的原样（组织、细胞、菌体等）湿重不少于100mg,如直接提供蛋白提取物，则浓度不少于4ug/ul，总量不少于5mg;
3.样品的还原和烷基化过程一般在制备时进行；
蛋白双向(2-D)电泳实验服务
实验技术简介：双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。[晶莱生物]
测序实验流程：
4.图象处理与切胶主要是手工操作成本。
实验介绍：
双向电泳将等电聚焦电泳和SDS-PAGE相结合，即先进行等电聚焦电泳，然后再进行SDS-PAGE，经染色得到二维分布的蛋白质图谱。
Bio-Rad蛋白质组双向电泳实验流程
Bio-Rad蛋白质组双向电泳实验流程
样品制备（Sample preparation）
•固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）
•第一向等电聚焦（IEF）
•胶条的平衡（IPG strip equilibration）
•第二向SDS-PAGE 电泳（SDS-PAGE electrophresis）
•凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
•PDQuest 软件分析（Software analysis）
•质谱鉴定（Protein identification）
目录
第一章实验材料
1．1 IPG 预制胶条及载体两性电解质
1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂
1．3 试剂盒及其试剂
1．4 化学试剂
1．5 蛋白质Marker
1．6 染色试剂
1．7 注意事项
第二章 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2. 1 溶液的配制
2. 2 SDS-PAGE 凝胶的配制
2. 3 操作方法
2. 4 注意事项
第三章双向电泳
3. 1 溶液配制
3. 2 操作步骤
3. 3 注意事项
附录1 双向电泳完整的操作步骤
附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置
附录3 细胞样品的一般处理步骤
附录4 组织样品的一般处理步骤。
蛋白质双向电泳的基本原理(一)
蛋白质双向电泳的基本原理(一)蛋白质双向电泳的基本原理蛋白质双向电泳是一种常用的分离和分析蛋白质的技术方法。
它通过利用蛋白质在电场中移动的特性，结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的分离和鉴定。
下面将从浅入深地解释蛋白质双向电泳的基本原理。
1. 电泳的基本原理电泳是一种基于物质在电场中迁移的原理，将带电粒子或分子分离开的技术。
在电泳过程中，带电的蛋白质分子会受到电场的作用力而移动，移动的速度与其电荷大小和分子质量有关。
2. 单向电泳的局限性在传统的单向电泳中，蛋白质样品被施加一个方向的电场，使得蛋白质分子按一维的方向进行迁移。
然而，由于蛋白质复杂性和电泳条件的限制，单向电泳难以有效地分离复杂的蛋白质混合物。
3. 双向电泳的优势双向电泳是为了克服单向电泳的局限性，实现更好的分离效果而发展起来的一种电泳技术。
它利用两个方向的电场交替施加，使得蛋白质分子在水平和垂直方向上均发生迁移，从而实现更高分辨率的蛋白质分离。
4. 蛋白质双向电泳的操作步骤•第一维电泳：将蛋白质样品在一个细长的电泳槽中垂直施加电场，使得蛋白质在水平方向上移动。
一般使用等电聚焦（IEF）技术，根据蛋白质的等电点来完成分离。
•电泳缓冲：在第一维电泳过程中，需要使用特定的电泳缓冲液，以确保蛋白质在移动过程中维持稳定的电荷状态。
•Gel转移：第一维电泳后，将蛋白质分离到一根细长的凝胶条上，凝胶条上有各种不同pH值的缓冲液。
•第二维电泳：将凝胶条垂直放置在另一个电泳槽中，施加另一个方向的电场。
凝胶条上的蛋白质会在垂直方向上继续移动，最终得到更高分辨率的蛋白质分离结果。
5. 蛋白质双向电泳的应用蛋白质双向电泳在生物医学和生命科学研究中得到广泛应用。
它被用于分离和鉴定复杂蛋白质混合物，寻找新的蛋白质标记物或生物标志物，研究蛋白质的功能和相互作用等。
6. 结论蛋白质双向电泳是一种重要的分离和鉴定蛋白质的技术方法，通过结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的高效分离。
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3
蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3 二、一向电泳（13cm的holder）（1）取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl（2）将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
（3）去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4）在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5）将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6）设置仪器的运行参数：三、胶条的平衡（由一向到二向）（1）将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（2）将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（3）用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳（1）将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.（2）设置仪器的运行参数：五、平板胶的染色硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
（3）清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml去离子水。
（6）终止：5%的醋酸。
（7）照相分析。
（8）保存制作干胶。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0. 2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点1.选择适合的样品预处理方法：蛋白质样品预处理的方法包括提取、富集和纯化等。
常见的方法有溶细胞法、组织破碎法和亲和层析法等。
根据具体实验目的和样品特点，选择适合的方法进行样品预处理是确保蛋白质样品质量的重要因素。
2. 选择合适的蛋白质溶液：根据目的不同，选择适于蛋白质分离的缓冲液和胶液。
常用的缓冲液有Tris-Glycine、Tris-Tricine和Tris-Acetate等，常用的胶液有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺/聚丙烯酰胺共聚物凝胶等。
根据蛋白质的特性和实验要求，选择合适的缓冲液和胶液可以提高分离效果和样品质量。
3. 蛋白质样品质量检测：在进行双向电泳实验前，需要对蛋白质样品进行质量检测。
常见的检测方法包括BCA法、Lowry法和Bradford法等。
这些方法可以测定样品中的蛋白质浓度，以确保实验的准确性和可重复性。
4.样品处理与加载：在进行双向电泳实验时，需要将蛋白质样品进行处理和加载，以便进行分离和鉴定。
样品处理的方法包括蛋白质还原、脱脂和蛋白质标记等。
蛋白质还原可使用还原剂如二巯基乙酸、巴布威和三丁基磺酸等，蛋白质脱脂可使用胰酶和胰酶胰凝乳酶等。
加载样品时，需要控制样品数量和均匀性，避免过多或过少的加载，以避免样品定位和分离差异。
5.电泳条件的优化：电泳条件的选择和优化是双向电泳实验的关键。
根据样品特性和实验目的，调整电场强度、升温速率和电泳时间等参数，以获得较好的分离效果。
此外，还需要注意电泳温度的控制，避免样品的热失活和电场影响。
6.截胶和染色：双向电泳实验结束后，需要进行截胶和染色步骤，以检测和鉴定分离的蛋白质。
截胶可使用染色剂如胭脂红和银染等，染色后可以通过人工或自动扫描仪对蛋白质进行定量和定位。
7. 数据分析和解释：双向电泳实验获得的数据需要进行分析和解释。
常见的数据分析方法包括质谱分析、2D胶电泳图像比较和蛋白质鉴定工具（如万得鉴定和Mascot等）。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
蛋白质双向电泳
实验报告蛋白质的双向电泳罗云云水产养殖20102190171、第一相等点聚焦电泳的胶条从负极到正极，pH如何排列，为什么？答：从负极到正极PH逐渐减小，也就是PH值小的的一端位于电泳的正极。
因为蛋白质在大于其等电点的PH环境中带负电，在小于其等电点的PH环境中带正点。
根据电泳时正电荷向负极移动原理，如果PH值小的一端位于负极，而此时带正电荷的蛋白质没法再向负极移动，因此只能是PH值小的一端位于正极。
即从负极到正极PH值逐渐减小。
2、为什么双向电泳（无论是第一相和第二相）过程中，要尽量消除气泡？答：第一向：如果在胶条和含蛋白质的水化液之间存在气泡，则气泡下面的蛋白质不能进入胶条。
对结果的影响可分为两种：①如果所有蛋白质在水化液中均匀分布，那么气泡只影响结果的显色程度，即银染后的黑色会减淡。
②如果某种蛋白质很少，恰巧只存在于气泡的下面，则气泡对结果的影响是严重的，直接影响电泳结果所能分析出来的样品中所含有的蛋白质的种类。
第二向：如果放入胶条时在胶条与电泳胶之间产生气泡，气泡会影响其所在通路上的电压分布。
其结果有两种：①蛋白质不能通过气泡，该处的蛋白质被遗漏。
②蛋白质可绕过气泡，但其所在跑道会发生偏移或改变，且移动距离也会发生改变，直接影响结果分析。
3、平衡液中的DTT和碘乙酰胺的作用是什么？答：①ＤＴＴ：即二流苏糖醇，它是一种还原剂。
可以还原蛋白质中的二硫键为巯基。
与巯基乙醇相比效果更好。
②碘乙酰胺：其所用是使蛋白质中由二硫键还原而成的巯基保持还原态。
其机制是在DTT作用的基础上使—SH与I—CH2—CO—NH2发生反映产生HI和—S—CH2—CO—NH2。
这样使—SH 不能复原。
4、水化液中CHAPS的作用是什么？它与SDS有什么区别？答：CHAPS是非离子型表面活性剂，有助于不易溶于水的蛋白质溶解。
SDS也是表面活性剂，但它是离子型的，与蛋白质结合后会使蛋白质分子带上大量的负电荷，从而影响蛋白质的等电点。
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蛋白质双向电泳实验
样品准备
liQ水反复洗3次，每次5000g离心5min。
2.尽量去除水分后，样品放-80度保存，避免反复冻融。
蛋白质提取
方法目前有2种
Tris-Buffer法（主要是水溶性蛋白）和尿素一步法（总蛋白）
尿素一步法
尿素裂解液
8M 尿素
2M 硫脲
4% CHAPS
1mM PMSF（放置10min）
65mM DTT（现加）
2% 两性电解质（现加）
蛋白复溶液
7M 尿素
2M 硫脲
4% CHAPS
2% 两性电解质（现加）
65mM DTT（现加）
用MilliQ水溶解定容。
10%TCA
TCA(三氯醋酸钠) 100g
MilliQ水800ml
定容至1L，-20度冰冻备用。
1.将样品（藻泥）从-80度取出，加入适量裂解液（100mg加1ml）。
2.反复吸打混均，取少量（10ul）镜检。
3.使用Glass-Beater或者超声波破碎仪破碎细胞。
具体视藻和仪器情况而定。
总的原则，每次处理的时间不要超
过20秒，避免样品过热蛋白变性。
另外从此步开始，所以实验均要保持低温，在冰浴上操作。
4.细胞破碎后，4度500g离心5min，取少量（10ul）镜检。
效果不好的重复步骤3.
5.冰浴静止30min后，4度40000g离心30分钟。
6.（此步为简易法，如若不需要可直接跳过，进行步骤7，直接测蛋白浓度后，用CleanUp试剂盒进行纯化，即
可用于双向电泳，或者采用传统的TCA丙酮沉淀法）
7.取上清液，加入10倍体积的冰TCA丙酮，吸打重悬混均后，-20度静置6小时。
8.4度40000g离心30min，沉淀加入等体积冰丙酮（加入1%的2-巯基乙醇）。
9.将沉淀彻底的用剪过的枪头捣碎，使之尽可能的溶解或者破碎成小块，越碎越好。
10.-20度静置3小时。
11.4度40000g离心30min，沉淀继续用等体积冰丙酮（加入1%的2-巯基乙醇）洗，直至上清液无色为止，大约
2-3次。
12.沉淀用惰性气体吹干，或者自然风干（不要超过5min）。
加入尽可能少的蛋白复溶液复溶，如果实在溶不了，
可以放在超声波清洗仪内，采用微波助溶的方式。
13.采用Bradford法测量蛋白质浓度，按照实验需要将蛋白样品分装后放在-80度保存。