生物技术制药期末解答

1.基因工程药物生产的过程：①基本过程：获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装②主要步骤：目的基因的克隆，构建DNA重组体，构建工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验。

③基因工程药物的生产必须首先获得目的基因，然后用限制酶和连接酶将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌，以便大量复制目的基因。

目的基因获得后，最重要的是使目的基因正确表达。

将目的基因与表达载体重组，转入合适的表达系统，获得稳定高效表达的基因工程菌。

2.基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。

基因工程菌的质粒不稳定常见的是分裂不稳定。

质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。

它主要与两个因素相关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关；二是这两种菌比生长速率差异的大小。

质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；在无同源性的两个位点之间也会发生缺失；培养条件也会对质粒结构不稳定性产生影响。

3.实现高密度发酵的方法：（1）发酵条件的改进①培养基的选择：高密度发酵过程中工程菌在短时间内迅速分裂增殖，使菌体浓度迅速升高，而工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质。

在培养基成分的选择上，要尽量选择容易被工程菌利用的营养物质。

普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。

其各组分的浓度也要比普通培养基高2-3倍。

②建立流加式培养方式：当碳源和氮源等营养物质超过一定浓度时可抑制菌体生长，这就是在分批培养基中增加营养物浓度而不能产生高细胞密度的原因，因此，高密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的，营养物则是在需维持高生长速率时才添加的，所以补料分批发酵已被广泛用于各种微生物的高密度发酵。

③提高供氧能力：在发酵过程中为提高溶氧浓度，现在的小型发酵罐一般采用空气与纯氧混合通气的方法提高氧分压，也可通过增加发酵罐的压力来达到此目的。

（2）构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌①阻断乙酸产生的主要途径②对碳代谢流进行分流③限制进入糖酵解途径的碳代谢流④引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌为了使对蛋白水解酶比较敏感的目标蛋白也能获得较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。

4. 生产用动物细胞的要求和获得①原代细胞：原代细胞是直接取自动物组织、器官、经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。

尤其是由于在组织块内常有多种细胞，而真正生产需要的只是其中的一小部分，因此用原代细胞来生产生物制品常需要大量的动物，费钱费劳力。

②二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。

它的染色体组型仍然是2n的核型；具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性；只有有限的增值能力，一般可连续传代培养50代；无致瘤性。

③转化细胞系：失去了正常细胞的特点，而获得了无线增殖的能力。

由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要。

④融合细胞系：不仅可使不同的动物和动物细胞融合，而且也可使动物和植物细胞融合，从而培养出一系列有其特性的杂种细胞和新的物种。

仙台病毒融合法；聚乙二醇融合法；电融合法。

⑤重组工程细胞系：在生产中采用更多。

5.动物细胞培养基的种类和组成①天然培养基：材料成分复杂，组分不稳定，来源有限，因此不适于大量培养和生产的需要。

②合成培养基：成分明确，组分稳定，可大量生产。

主要组成：1 氨基酸：是细胞合成蛋白质、维持细胞生命不可缺少的物质。

2 维生素：是一类重要的维持细胞生命活动的低分子活性物质，多数是形成酶的辅基或辅酶。

由于它们不能靠细胞自己合成，或合成不足，所以必须从培养基中供给。

3 糖类：细胞的生长需依赖于碳源，它是维持细胞生命活动的能量来源。

主要是葡萄糖和谷氨酰胺。

4 无机盐：保持细胞的渗透压，缓冲PH的变化，并积极参与细胞的代谢。

5 其他成分：加核酸的前体，一些氧化还原剂。

血清的作用机制：1提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；2提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；3提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白；4提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素；5提供良好的PH缓冲系统。

6. 单克隆抗体：抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的。

多克隆抗体：由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体7.以单抗作为载体治疗的障碍：①单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；②完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。

8.改形抗体：用鼠源性单抗CDR序列替换人IG分子CDR序列，使抗体既具有单抗的特异性，又能消除免疫原性。

9.概念：①植物的分化：可分为胚胎发生和器官发生两个阶段。

前者从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚，进而发育为成熟胚和种子。

种子在适宜的条件下萌发，通过器官分化过程，形成根、茎、叶、花和果实。

②脱分化：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程。

③再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。

愈伤组织形成胚状体一般有两个途径：1 由体细胞或性细胞，通过脱分化形成胚状体。

2 通过愈伤组织直接形成胚状体。

④植物激素：是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程产生作用。

⑤抗生素：由微生物产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质。

⑥植物杀菌素：高等植物如葱、蒜、辣椒等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素。

⑦书189植物生长调节剂 看10. 影响植物次级代谢产物产生和积累的因素主要有：①生物条件，如外植体、季节、休眠、分化等；②物理条件，如温度、光（光照时间，光强，光质）、通气（氧气）、pH 和渗透压等； ③化学条件，如无机盐（N 、P 、K 等）、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等；④工业培养条件，如培养罐类型、通气、搅拌和培养方法等。

11.两步培养法：第一步使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基；第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。

两种培养基各有特点：前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或较少的碳源。

12. 酶工程：是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。

13：14.固定化细胞的特点：（1）优点：.酶和细胞固定方法载体结合法 交联法 包埋法 物理吸附 热处理细胞共价结合 离子结合 网格型 微囊型①无需进行酶的分离纯化；②细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；③细胞内酶比固定化酶稳定性更高；④细胞内酶的辅因子可以自动再生；⑤细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；⑥抗污染能力强。

（2）局限性：①利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；②细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；③载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。

15.模拟酶：根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。

16.酶化学的修饰：概念：通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。

目的：人为地改变天然酶的一些性质，创造出天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。

变化：①提高生物活性②增强在不良环境中的稳定性③针对异体反应，降低生物识别能力。

方法：1、酶的表面化学修饰2、酶分子内部修饰3、结合定点突变的化学修饰17.有机相酶反应：指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。

优点：①增加疏水性底物或产物的溶解度；②热力学平衡向合成方向移动，如酯合成，肽合成等；③可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等；④酶不溶于有机介质，易于回收再利用；⑤容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；⑥酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大；⑦无微生物污染；⑧能测定某些在水介质中不能测定的常数；⑨固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面。

18. 正变菌株：变异个体中一种是生长良好，生产水平提高，对生产有利。

负变菌株：生产能力下降，形态出现异型，生产水平下降，导致菌种退化。

19.发酵基本过程:菌种种子制备发酵发酵液预处理提取精制20.发酵方式：分批发酵：全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出。

补料分批发酵：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长。

连续发酵：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养，发酵反应器中的细胞总数和总体积保持不变，发酵体系处于平衡状态，发酵液中的各个变量都能达到恒定值而区别于瞬间状态的分批发酵。

21.温度对发酵：（生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热）①影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质，改变菌体代谢产物合成方向，对次级代谢产物比例造成影响②影响发酵液的物理性质（粘度、基质、氧气溶解度和传递速率等），进而影响发酵的动力学特征和产物的生物合成。

控制：冷却水通入夹层或蛇形管，通过热交换来降温；通过冷冻盐水来降温22.溶氧对发酵：溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，太高有时候抑制产物形成控制：供氧方面提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数的值（调节搅拌转速）。

需氧方面控制最适菌体溶度（比生长速率比临界值稍高一点），通过控制基质的浓度，调节温度，液化培养基，中间补水等。