RNA提取及常见失败原因
为什么你抽提不好RNA？
为什么你抽提不好RNA？RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。
事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA 更方便，成功率也更高。
那为什么同样的方法用于组织RNA 的抽提，总会碰到问题呢？RNase 真的很顽固吗？刚涉及 RNA 抽提的新手都会听到别人说 RNase 很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。
于是在配制Tris 缓冲液时就遇到了两难的境地。
Tris 缓冲液不能用 DEPC 处理，只能用 DEPC 处理过的水配制，那么在药品称量、调 pH 值等过程中 Tris 缓冲液会造到 RNase 的再次污染，所以是一个两难的境地。
但是今天我要谈的是 RNase 并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。
下面的实验照片很清楚的显示了高压灭菌的效果。
实验很简单，将不同含量的RNase 用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的RNase 一起来降解 RNA（37 度 1 小时），结果表明，当 RNase 的污染量小于 100 ng/ml 时，高压灭菌可以去除其活性。
这张照片还说明了一个问题，当你的RNA 溶液中含有很微量的RNase 污染时，不用过于担心，因为 RNase 对 RNA 的降解是需要时间的，更何况你的 RNA 是存放在低温下的。
DEPC 操作误区误区一：重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。
由于 DEPC 较贵，而且书上说 DEPC 要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用 DEPC 的想法，即对含有 DEPC 的水不进行高压灭菌，从而重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。
节约本是好事，但这样的节约是无效的。
为什么不能重复使用含DEPC 的水？因为 DEPC 在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC 在 pH 6.0 和 pH 7.0 的 PBS 缓冲液中的半衰期分别约为 20 min 和 10 min，DEPC 在水中的半衰期约为 30 min。
RNA提取常见问题、原因分析及其对策
RNA提取常见问题、原因分析及其对策一、RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法（即TriZol类试剂）细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
步骤:材料准备：尽量新鲜。
裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。
使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。
纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。
苯酚/氯仿可抽提去除杂物。
洗涤：70％乙醇。
沉淀：异丙醇、无水乙醇。
乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。
此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。
二、影响RNA提取的因素由于RNA样品易受环境因素特别是RNA酶的影响而降解，提取高质量的RNA样品在生命科研中具有相当的挑战性。
RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。
1.材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料，如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。
可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存，液氮长期保存，－70℃短期保存。
2.样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。
期间动作快速，样品保持冷冻，样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量3.纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。
RNA提取常见问题分析与解答
1、RNA降解A、新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。
如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。
B、新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。
更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
C、冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。
样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。
冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。
样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。
样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
D、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
E、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。
2、OD260/280比值偏低A、蛋白质残留使用酚氯仿抽提，去除残留的蛋白质（但经此步骤操作，约损失40%的RNA）。
B、盐分残留加入2.5倍体积的无水乙醇和终浓度是0.1M的NaCl沉淀RNA，-20℃放置30分钟充分沉淀RNA，然后4℃下10,000×g离心15分钟收集沉淀，溶于DEPC处理过的水中。
C、设备限制测定OD260及OD280数值时，使OD260读数在0.1-0.5之间。
此范围线性最好。
用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。
用水作为稀释液将导致比值偏低。
3、RNA提取得率低A、使用样品过多，超过吸附柱的最大结合量使用过多的样品，将会导致RNA的降解。
B、Wash Buffer中未加入无水乙醇使用前，需在DNA Wash Buffer和DNAse I Stop Buffer 中加入无水乙醇。
提取RNA原理及其常遇到的问题
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
抽RNA
Trizol总RNA提取试剂2009-03-19 13:35:04| 分类：学习中的点点滴滴| 标签：|字号大中小订阅一、原理硕盟TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。
在样品处理过程中，TRIzol可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。
加入氯仿离心后，溶液形成上清层（水相）、中间层和有机相（下层）。
取出上清层，可用异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。
硕盟TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取，也可用于大量样品的RNA提取。
提取RNA 整个过程方便快速，整个操作过程可一个小时内完成，提取的RNA无蛋白和DNA的污染，纯度髙，可直接用于Northern Blotting、斑点杂交、polyA筛选、mRNA纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
二操作步骤RNA提取过程的关键是建立一个无RNase的实验环境，因此在整个操作过程中要防止RNase的污染，应注意以下几点：1. 实验过程中经常更换新手套，使用专用超净台，在操作过程中避免讲话；2. 应尽量使用无RNase的实验器材；枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理过夜，然后在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。
玻璃制品也可用干热灭菌去除RNase（180℃烘烤2h）；3. 配制溶液应使用无RNase水（无RNase水的配制方法：双蒸水加入DEPC至终浓度0.01％V/V，放置过夜，然后120℃下高压灭菌30min，备用）；4. 整个实验过程中使用的试剂，实验器材和无RNase水应专用，避免交叉污染。
用户自备试剂：氯仿、异丙醇、75％乙醇（用DEPC处理过的水配制）、无RNase的无菌水。
1. 样品处理A贴壁培养细胞①倒净培养液；②每10cm2生长的培养细胞中加入1mL硕盟TRIzol试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落；1. ③将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；B悬浮培养细胞1. ①直接离心收集细胞，倒净培养液；2. ②细胞沉淀中每5～10×106细胞加入1mL硕盟TRIzol试剂；3. ③将细胞裂解液转移至离心管中，并用1ml枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；C动、植物组织材料1. ①将组织在液氮中磨碎成粉末状（应无明显颗粒）；2. ②每50～100mg的组织加1mL硕盟TRIzol试剂，样品的体积不应超过TRIzol试剂体积的10％，并用匀浆器进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；3. ③将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；4. ④12,000g，4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；2. 2．向上述步骤1得到的裂解液中加入氯仿（每使用1mL硕盟TRIzol加0.2mL氯仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s（请勿涡漩激烈振荡），得粉红色浑浊液，无分层现象，室温静置3min；3. 3．12,000g，4℃离心15min；4. 4．取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。
RNA提取常见问题分析
RNA提取常见问题分析一、提取过程中RNA降解1、样品中的RNA发生降解尽量选择新鲜的样品，样品采集后应迅速用液氮处理。
材料保存在液氮中或-80℃条件下，材料均不宜长期保存，且避免反复冻融。
幼嫩新鲜的材料RNA含量高且完整，衰老或病害等受损的材料中RNA降解比较严重。
2、操作环境的RNase污染RNA提取尽量选择洁净的环境，由于自然条件下空气中含有较多的RNase，建议对提取环境进行RNase的清除处理。
3、提取用具带来的RNase污染提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活（160℃烘烤4-5 h）去除RNase。
RNA样品所接触的所有塑料制品（如枪头、电泳槽、移液器等都需要通过DEPC或NaOH处理严格去除RNase后才可使用4、RNA溶解用水带来的RNase污染配制DEPC处理水时需剧烈振荡使DEPC与水充分接触反应（DEPC 与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分）。
DEPC处理后应避光静置过夜，高压灭菌。
5、操作中带入的RNase污染人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的RNase。
操作人员可通过经常更换一次性手套，佩戴口罩等措施减少此类污染。
二、RNA提取量低材料RNA含量较低对于RNA含量较低的纤维组织（肌肉组织或纤维素较高的植物组织）可适当提高起始材料的用量。
材料中蛋白和脂肪含量较高蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。
RNA沉淀条件不合适使用异丙醇沉淀RNA中，加入的异丙醇与提取液的比例为严格的1 ：1 ，否则会明显影响RNA沉淀的效率和RNA的纯度。
特殊材料（如含有多糖、多酚等）可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。
RNA中有基因组DNA 污染材料中核酸含量高脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高，可进行多次酚氯仿抽提以去除多余的DNA。
也可以在提取后加入DNase处理，降解DNA 。
RNA沉淀条件不合适使用异丙醇沉淀RNA中，加入的异丙醇与提取液的比例偏高溶液的pH值偏小，都容易使DNA形成沉淀。
提取RNA原理及其常遇到的问题
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
RNA提取常见问题分析
RNA提取常见问题分析1 RNA抽提中自备有机溶液的配制及保存问题2总RNA 的非变性电泳检测3 RNA质量检测与鉴定4 关于RNA样品中基因组DNA污染的问题1 RNA抽提中自备有机溶液的配制及保存问题RNA 抽提中涉及的有机试剂包括苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇等。
苯酚的使用和保存：苯酚基本已经商品化，选择和保存都不应该有什么问题，4℃避光保存即可；只强调一点：尽管Tris 饱和的苯酚也可以用于RNA 的抽提，但使用水饱和苯酚会更好一些，因为RNA 在pH 7 以上的溶液中，发生降解的机率大大提高。
下面是关于氯仿、异丙醇、乙醇的有关建议。
选择：国内大的化学试剂公司生产或者监制的分析纯级别试剂（AR）就完全可以满足要求。
如国药集团，西陇化工等。
预处理：不需要进行任何的预处理。
绝对不可以高温高压灭菌，这三种试剂的沸点都低于100℃，高温高压可能导致危险。
75% 乙醇的配制一份无菌无酶的水（DEPC水）与 3 份(体积)无水乙醇混匀即成。
不要使用量筒等过渡容器。
事实上，70% - 80% 的乙醇都具有较好的洗涤能力，使用都不会导致片段比较大的核酸的丢失，所以，配制时就不要为了准确而左勾右兑。
75% 乙醇也不可以高温高压灭菌，原因同无水乙醇。
保存：第一，要使用新的未开封的试剂，用后做好标记。
其次，分成相对小一点的包装(50ml –100ml)；500ml 的瓶子取液是非常不方便的，移液器的杆子往往都进入了瓶口里，非常容易造成污染。
第三，塑料瓶子密闭性好，装醇类试剂是非常好的选择；但氯仿绝对不要使用塑料瓶子。
第四，盖紧瓶盖，作好标记。
第五，保存于室温。
将有机试剂保存于冰箱的人不在少数，但这么做却是令人奇怪的。
首先，任何挥发性的东西都不保存在冰箱(除非万不得已，如DEPC)。
其次，与外面相比，冰箱除了灰尘少一点外，什么都会比外面多。
第三，在室温打开低温的瓶子，将导致空气大量进入瓶子，增加了污染的风险。
使用：非常幸运的是，有机试剂对菌污染和酶污染似乎有我们想象不到的抑制和灭活作用，所以，使用这些试剂没有特殊的要求，按正常抽提RNA 的要求就完全可以了。
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RNA提取及常见失败原因
1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。
2. 将匀浆室温放置5 min。
3. 加入200 μl 氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3 min。
4. 12000 rpm，4℃离心15 min。
5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取400 μl ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。
（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。
）
6. 12000 rpm，4℃离心15 min 。
7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
8. 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700 μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。
（此时RNA是不溶解的）
9. 8000 rpm，室温离心10min。
10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。
11. 真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。
12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。
如发现沉淀难溶，68 ℃处理10 min。
13. RNA检测
(1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值
按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。
OD260/OD280在1.8-2.0 。
(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定
RNA的完整性和污染情况。
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低得率原因:
A．样品裂解或匀浆处理不彻底
B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。