sephadex知识剖析
sephadexg100柱层析原理
sephadexg100柱层析原理
Sephadex G-100柱层析是一种凝胶过滤柱层析方法，用于分离和纯化生物分子，例如蛋白质、核酸和多肽等。
基于凝胶过滤原理，Sephadex G-100是由纤维素经化学修饰得到的高分子化合物，具有高度多孔的三维网状结构。
其孔径大小可根据需要进行调整，常用的G-100型号指的是其平均孔
径大小为100 Å。
在Sephadex G-100柱层析中，样品溶液首先被添加至柱层析
填料中，然后以缓冲液进行洗脱。
由于Sephadex G-100的高
度多孔结构，较大分子无法进入凝胶内部而被排除在外，较小分子则能够进入凝胶内部并逐渐渗透到凝胶颗粒深处。
因此，分离的结果是根据生物分子的大小而实现的，较大分子在柱顶部洗脱，较小分子则需要更长的时间才能出现在柱底部。
通过Sephadex G-100柱层析，可以实现蛋白质的初步纯化和
分子量测定，以及核酸和多肽的分离纯化。
此外，Sephadex
G-100柱层析方法简单、操作方便，并且具有较高的分离效率，因此在生物学和生物化学实验中得到广泛应用。
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，pH8.0)：取Tris 1.2114g和NaCl 5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至8.0，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材： 18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。
有关sephdax的处理问题
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
Sephadex LH-20 层析原理和应用基础
图 6 在理想的球形填料中大为简化溶胀凝胶粒子
DataFiles：TCM-2003-02AA
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摘自 Hans Henke 著 Preparative Gel Chromatography on Sephadex LH-20
3.流动相对分离的影响
3.1 甲醇作为流动相
除水外，甲醇是多年来一直在日常使用的极性最强的流动相。如已经叙述的，各种溶剂同 Sephadex LH-20 构成不同的分离系统，这些系统专用于某些类型的化合物。甲醇的一个引人注 目的性质是，由葡聚糖凝胶对芳族和杂环化合物的保留比对来自这种极性和质子溶剂的相应的 脂肪族和脂环族化合物强的多。Sephadex LH-20/甲醇分离系统还有一个特点是选择保留芳族化 合物。苯环上存在的官能团或杂原子是芳族化合物保留的原因。杂原子或官能团的性质、数目 和位置决定了物质的保留行为，而不管它们是脂族的、芳族的或杂环族的。不同的停留时间是 由于氢键的质量和数量的差别，这种氢键是作为溶解在流动相的样品成分和凝胶基体之间的弱 的离子的可逆键。
流动相
极性* （见 a））
折射率 nD20
粘度厘泊 Cp（20℃）
溶胀容量 b12)
(凝胶床的体积)* 毫升/克干凝胶 b)
沸点 ℃
N-甲基-2-吡咯烷酮
-
பைடு நூலகம்
1.4700
-
5.0-5.3
81
水
高 C）
1.3330
-
4.0-4.4
100
甲醇
0.95
1.3290
0.60
3.9-4.3
65
氯仿 d)
0.40
3
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凝胶Sephadex LH-20使用方法及注意事项
凝胶使用方法及注意事项1原理Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
2.前处理及装柱Sephadex LH-20在使用前必须进行溶胀，溶胀过程中必须避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒。
（1）室温下，将凝胶溶胀于层析液（一般为甲醇）中至少三小时（2）使溶胀胶体积沉淀后占总体积的75%，上层溶剂占25%凝胶悬浮液黏度要适宜A．太稠会在搅拌时产生气泡；太稀会导致装柱时沉降时间长，加凝胶悬浮液的次数增加；B．将凝胶悬浮液静止后所得上清液弃去，保留高于凝胶液面约1 cm的液体即可；C 装柱混悬液的浓度以流动性好，搅拌阻力小为宜。
（3）装柱的要点A 装柱前，先在色谱柱中加入约1/4柱高的液体（溶胀时所用的试剂）；B 装柱时，将下端活塞打开，流速尽量大，但要保证小于凝胶沉降速度，否则会干柱；C将凝胶悬浮液搅拌均匀，以漏斗倒入柱子中即可；3.流动相1.分子筛作用，常用的是甲醇、甲醇+氯仿混合溶剂。
甲醇：氯仿一般为1：1左右，切不可用氯仿做为流动相！氯仿比重大，用单纯的氯仿做流动相，填料将浮起来，严重影响分离效果！！2.反相分配作用，常用的是甲醇/水，比例可以根据实际情况进行调整，也可以是梯度洗脱（先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱）4.样品的处理及洗脱过程（1）.最重要的一点：用尽可能少的溶剂溶解样品，样品可以很浓。
如果溶解体积很大，一定要先进行浓缩，否则基本没有多大的分离效果。
上样体积一般为柱体积的1%~5%。
（2）.很重要的一点：尽可能用起始洗脱溶剂溶解样品（很多情况下样品并不能在起始溶剂中很好地溶解）。
sephadex g-10葡聚糖凝胶 孔径
1. 概述Sephadex G-10 是一种常用的葡聚糖凝胶，具有广泛的应用范围。
在生物化学、分子生物学等领域中，它被广泛用于分离和纯化生物大分子，例如蛋白质、核酸等。
而Sepahdex G-10的孔径大小则是影响其分离和纯化效果的重要因素之一。
2. Sephadex G-10的基本介绍2.1 Sephadex G-10是一种由交联葡聚糖制成的凝胶，属于凝胶过滤层析介质的一种。
它以其较大的孔径而闻名，这使得它在许多生物大分子的分离过程中具有重要的应用价值。
2.2 Sephadex G-10的结构具有高度规则的孔隙结构，能够可靠地分离分子，并且不易受到外界因素的影响。
2.3 在分子生物学和生物化学的实验中，Sephadex G-10经常被作为一种理想的分离介质，用于分离蛋白质、核酸等大分子物质。
3. Sephadex G-10的孔径大小3.1 Sephadex G-10的孔径大小通常为10微米左右。
这种中等大小的孔径使得它能够有效地分离分子，但也相对于有一定的分辨能力，不会因为孔径过大而导致分离效果不理想。
3.2 对于一些较大的生物大分子，例如大分子蛋白质、核酸等，Sephadex G-10的孔径大小能够保证其能够顺利地通过凝胶中的孔隙，实现有效的分离和纯化。
4. Sephadex G-10的孔径大小对分离效果的影响4.1 由于Sephadex G-10的孔径大小适中，它能够较好地区分不同大小的分子。
对于较小的分子而言，它们能够更容易地穿过Sephadex G-10的孔隙，实现快速的分离。
4.2 对于较大的生物大分子，Sephadex G-10的孔径大小也能够保证其能够通过凝胶的孔隙，实现高效的分离。
这就体现了SephadexG-10的孔径大小对于分离效果的积极影响。
5. 结语Sephadex G-10作为一种常用的葡聚糖凝胶，在分离和纯化生物大分子的过程中具有重要的应用价值。
其孔径大小的适宜性，使得它能够有效地区分不同大小的分子，实现高效的分离和纯化。
用sephadexG分离核黄素与丙
葡聚糖凝胶G50的性质
• 干粒直径：粗粒100~300中粒50~150细粒 20~80极细10~40 • 吸水量：5.0±0.3mL/g干凝胶 • 膨胀体积：9~11mL/g • 分离肽或球状蛋白：1500~30000 • 浸泡时间：20℃需3h;100℃需1h
名词解释
核黄素：维生素B2，又称核黄素，维他命B2。 分子式C17H20N4O6。作为维生素B族的成员 之一，核黄素水溶性较低，但在碱性溶液 中容易溶解，在强酸溶液中稳定，光照及 紫外照射引起不可逆的分解。可溶于氯化 钠溶液，维生素B2是机体中许多酶系统的 重要辅基的组成成分，参与物质和能量代 谢。核黄素在机体中有递氢的作用，并是 机体中一些重要的氧化还原酶的辅酶。
• 交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸 水后体积膨胀越少。凝胶的型号就是根据吸水量 而来，如G25的吸水量（1g干胶所吸水为25mL） 型号数字相当于吸水量乘以10 • 葡聚糖凝胶的化学性质比较稳定，不溶于水，弱 酸、弱碱和盐溶液。本身具有很弱的酸性。在 120℃加热30分钟灭菌而不被破坏。但高于120℃ 即便黄，若长时间不用，需加防腐剂
• 洗脱：样品一旦加入后马上用量筒或刻度 离心管收集流出液，床柱上不断加蒸馏水， 待红色（血红蛋白）流出一半时记录核黄素）流出一半时记录体积， 此时核黄素Ve • 用蒸馏水反复加在柱床上面，洗柱10分钟， 然后将主柱内凝胶回收在凝胶瓶内
实验中注意事项
• 在收集过程中，要保持流出液的流速稳定， 洗脱速度控制在4滴/min • 加样时保持凝胶上平面不被搅动 • 液面始终高于凝胶平面否则会导致干柱 • 装柱避免出现断层、气泡
核黄素与丙种球蛋白
谢谢观看
• 丙种球蛋白：按其来源不同可分为两种， 一种是从健康人静脉血中提取制成的人血 丙种球蛋白，另一种是从健康人胎盘血中 提取制成的人胎盘血丙种球蛋白。二者作 用相同，后者价格低于前者，且用量多于 前者，但目前已停产。有些人盲目地、错 误地认为丙种球蛋白是营养药、是补针， 于是不管病情轻重、有病无病地滥用，结 果会导致不良反应
SephadexG25凝胶层析专题知识
层析柱旳预备 ↓
装柱 ↓
平衡 ↓
加样与洗脱 ↓
试验操作
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水 中
浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待 凝胶
沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复屡次。
（2）层析柱旳预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗洁净。 固
定好层析柱各处旳接口，用水检验层析柱各处旳接口密 封性。
常用旳层析措施：凝胶层析、离子互换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。
此次试验用旳是凝胶层析，凝胶层析旳固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用旳是混合物中多种成份大小不同 这种原理特征来分离混合物。
试验原理
凝胶层析柱中装填着许多直径不不小于1mm旳凝 胶颗粒，
颗粒内部不是实心旳，而是呈三维多孔网状构造。 在洗
思索题
（1）阐明凝胶层析旳原理 （2）层析柱中旳“纹路” 、气泡和凹凸不平 旳床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间旳U形导 管，有预防层析床液体流干旳作用，阐明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能确保操作压旳恒定？
谢谢欣赏
SephadexG25凝胶层 析专题知识
引言
层析技术分离纯化生物大分子利用那些物 理化学性质上旳差别？
血红蛋白旳相对分子质量与核黄素旳相对 分子质量差别很大，采用什么技术分离它 们？
采用该技术分离血红蛋白与核黄素需要到 哪些试验器材与试剂？
试验目旳
（1）掌握凝胶层析旳原理 （2）掌握柱层析旳基本装置 （3）熟悉凝胶层析旳操作过程
脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因 其直
径不小于凝胶网孔旳孔径，不能进入凝胶颗粒内部， 只能
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【操作步骤】
（1）A-50经酸碱处理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L， pH7.4 PB中，置4℃冰箱储存备用。 （2）装柱：同DE52。 （3）平衡：松开出水口螺旋夹，以PB平衡，控制流速为 15滴/min，• 待洗脱液与流出液之pH值达到一致时，停止 平衡。 （4）加样、洗脱、收集与浓缩：基本上同DE52，以 0.1mol/L PB洗脱。 用过的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗 脱回收。洗至流出液中无蛋白（OD280nm<0.04）后再用 蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
Sephadex系统知识
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶系列是当今生物大 分子分离、提取、纯化的重要分离材料， 按性能分包括 凝胶过滤、 离子交换、 疏水层析、 亲和层析，
主要用于蛋白质、核酸、多肽、多糖、酶的脱盐 与分离纯化中。 葡聚糖凝胶为葡聚糖和环氧氯丙烷交联而成的 珠状产品，化学性能稳定，在潮湿、中型ph、高 压120度，灭菌30min情况下，不影响色谱性能， 适用于柱色谱操作。用于蛋白质脱盐及不同分子 量蛋白在凝胶分离范围内的分离纯化，可在酶、 多糖、核酸和其它生物大分子的纯化中广泛应用。
葡聚糖凝胶LH
用途：分离水不溶物质。 葡聚糖凝胶LH-20/Sephadex LH-20 分离中 等大小生物分子，球蛋白分离范围100～ 4000 葡聚糖凝胶LH-60/Sephadex LH-60 分离 100～20000
葡聚糖凝胶C阳离子交换剂，吸附碱 性蛋白：
羧甲基葡聚糖凝胶C-25/CM葡聚糖凝胶C-25/CM Sephades C-25 应用：MW＞20000；载量4-5mmol/g 羧甲基葡聚凝胶C-50/CM葡聚糖凝胶C-50/CM Sephades C-50 应用：中等大小生物分子（30－200KD）；载量45mmol/g SP葡聚糖凝胶C-25/SP Sephades C-25 应用：MW>200 KD；载量：2.0-2.6mmol/g SP葡聚糖凝胶C-50/SP Sephades C-50 应用：中等大小 生物分子（30－200KD）；载量：2.0-2.6mmol/g
葡聚糖凝胶G分子筛：
葡聚糖凝胶G-100/交联葡聚糖凝胶G-100/Sephadex G100 分离：肽及球形蛋白质：4000～150000；葡聚糖 （线性分子）：1000～100000 葡聚糖凝胶G-150/交联葡聚糖凝胶G-150/Sephadex G150 分离：肽及球形蛋白质：5000～400000；葡聚糖 （线性分子）：1000～150000 葡聚糖凝胶G-200/交联葡聚糖凝胶G-200/Sephadex G200 分离：肽及球形蛋白质：5000～800000；葡聚糖 （线性分子）：1000～200000
2．A-50柱层析法
【材料和试剂】 （1）DEAE-Sephadex A-50。 （2）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫 血清或饱和硫酸铵粗提品。 （3）1.5×50cm 层析柱；透析袋及其他透析和 层析所需的试剂和器材。 （4）PB缓冲液：0.1mol/L，pH7.4 Na2HPO4NaH2PO4缓冲液。
【操作步骤】
（1）A-50的预处理：称取4～6g A-50悬浮于 500～1000ml蒸馏水中，1h后倾去上层细粒。然 后将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液（60～100ml） 中，搅拌后静置30min，• 以蒸馏水洗至中性，再 用0.• 1mol/L NaH2PO4同上操作过程处理• ，蒸馏 水洗至中性。最后用0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB）平衡，减压 抽干，保存备用。
（2）吸附提取：取15ml血清加等量0.01mol/L， pH6.5 PB稀释至30ml（也可不稀释• ），加入1/4 体积滤干的DEAE-Sephadex A-50（相当于干重 1g）混合。室温（或4℃）浸泡• 1 h后过滤，收 集滤液。再加入同样体积的DEAE-Sephadex A50重复上述处理过程共• 3次，亦可在血清内加入 过量DEAE-Sephadex A-50吸附处理一次。收集 滤液合并，• 即为提纯的IgG制品。或再透析去盐， 浓缩、冻干保存备用。
1. 批量吸附法
此法可在1天内完成提取过程，纯化前后样 品体积变化不大，• 所得IgG无变性现象，抗 体效价亦无明显降低。制品可达PAGE及免 疫电泳纯。适用于提纯人、羊、兔等血清 中的IgG。
【材料和试剂】
（1）DEAE-Sephadex A-50。 （2）PB缓冲液：0.01mol/L， pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
葡聚糖凝胶QAE-A阴离子交换剂， 吸附酸性蛋白：
葡聚糖凝胶QAE-A25/QAE Sephades A-25 应用： MW>200 KD；载量2.6-3.4mmol/g 葡聚糖凝胶QAE-A50/QAE Sephades A-50 应用： 中等大小生物分子（30-200KD）；载量2.63.4mmol/g DEAE葡聚糖凝胶A-25/DEAE SephadexA-25 应 用：MW>200 KD；载量3-4mmol/g DEAE葡聚糖凝胶A-50/DEAE Sephadex A-50 应 用：中等大小生物分子（30-200KD）；载量A-50提取法纯化 多克隆抗体
DEAE-Sephadex A-50（简称A-50）为弱 碱性阴离子交换剂，经过NaOH处理将Cl型转为OH-型后，可吸附酸性蛋白。γ1球蛋 白属中性蛋白，等电点为pH6.85～7.5，其 余均属酸性蛋白。在溶液为pH8.0时，酸性 蛋白均被A-50 吸附。从而可分离纯化IgG。