转染缺氧诱导因子_1_对肺癌细胞A549生长的影响
桦褐孔菌的药用功能概述
桦褐孔菌的药用功能概述张蕾;王雪【摘要】桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是主要产于俄罗斯的一种药用型真菌,包含多种活性物质如羊毛甾醇三萜类、桦褐孔菌醇、桦褐孔菌素、多糖、木质素、生物碱、栓菌酸和黑色素等.桦褐孔菌被应用于各种疑难杂症,其入药部位主要是菌核,大量药理实验表明其有抗氧化、调节血脂、抗癌症(肝癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、直肠癌)、治疗糖尿病、抗病毒、抗衰老和增强免疫力等作用.主要对桦褐孔菌的药用功能进行概述,并对其未来发展进行展望.【期刊名称】《中国林副特产》【年(卷),期】2018(000)004【总页数】4页(P83-86)【关键词】桦褐孔菌;真菌;药用功能【作者】张蕾;王雪【作者单位】牡丹江师范学院生命科学与技术学院 ,黑龙江牡丹江 157012;牡丹江师范学院生命科学与技术学院 ,黑龙江牡丹江 157012【正文语种】中文【中图分类】R282.71;R965桦褐孔菌 (Phaeoporus obliquusJ. Schroet)，也称作桦树茸、白桦茸，被赞誉为“西伯利亚灵芝”，是一种非常珍稀而名贵的药用真菌，生长在温度相对较低的俄罗斯西伯利亚地区的原始森林中，不能人工栽培，非常稀少，颜色呈现出深栗色，常在树皮破损及伤节处形成肉瘤状菌核，菌块性状为近球形或不定形块状。
近年来随着人们生活质量的提高，更多的人开始了解天然食品和保健药物，由此引起世界各国学者对桦褐孔菌的广泛关注。
1 桦褐孔菌的药理活性1.1 抗氧化、降血脂作用抗氧化全称为抗氧化自由基，人体在与外界密切接触的过程中，具有强氧化性的自由基会不断的在体内产生并累积。
大量研究表明，某些疾病、细胞癌变以及癌症的发生和机体衰老常常伴随着过量自由基的蓄积。
常见的合成抗氧化剂可能具有生物毒性，以至于近年来新型抗氧化剂的开发热点主要为天然活性物质。
梁丽雅等[1]的研究结果表明桦褐孔菌提取物在生物的体内和体外都具有强还原性，一方面可以有效清除氧化自由基，另一方面能提高机体消除超氧阴离子、羟自由基的活性，其中以乙酸乙酯作为萃取剂效果最为突出。
缺氧对人非小细胞肺癌细胞系A549生物学行为的影响
浙江实用医学 ２ ０ １ ３ 年２ 月第 １ ８ 卷第 １ 期Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｐ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｆ ｅ ｂ ｒ ｕ ａ ｒ ｙ ， ２ ０ １ ３ ＂ ． Ｖ ｏ １ ． １ ８ ， Ｎ ｏ ． １
・ ｌ ５ ・
【 关键词】 靠小细 胞肺癌 Ａ ５ ４ ９ 缺氧
生物学行 为中肿瘤微 环境的一个显著特点 就
是局 部低 氧 ， 恶性 肿瘤 在 生 长 过 程 中 由于 组 织增 生 过快 必然 会 造 成 局 部 缺 氧 和供 能 与 消 耗 之 间 的不
培养 ４ 小时， 弃上清液加 ２ ０ ０ ｔ ｔ Ｌ Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ ， 振荡 １ ０ 分钟 ， 用酶标仪 测定 ４ ９ ０ ｎ ｍ处各孔 的吸光度值 。计算 生 存率 ： 生存率 ＝ 实验孔 Ａ值／ 对照孔 Ａ值 ×ｌ ｏ ｏ ％。 １ ． ３ 缺氧对 Ａ ５ ４ ９ 细胞系凋亡 的影响 取对数生 长期细胞进行缺氧和常氧培养 ２ ４ 小时 ， 干预结束
ｔ ｒ ｉ ｇ ｅ ｌ 胶 和上 室 内 的 细胞 ， 乙醇 固定 后 结 晶紫 染 色 ，
胞培养基为含 １ ５ ％胎牛血清的 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０ ， ３ ７ ｏ Ｃ、 ５ ％ ｃ Ｏ ２ 和９ ５ ％０ ２ 的培养箱 中传代培养。取对数生长 期细胞 ， 传代后 （ 未贴壁 ） 立 和９ ５ ％０ ２ 的培养箱 中培养 ， 缺氧培养
黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力及HIF-1α
黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力及HIF -1α/VEGF 信号通路蛋白表达的影响陈静，田伟平，韦小白上海市静安区中心医院肿瘤科，上海200040摘要：目的 探讨黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力的影响及其机制是否与缺氧诱导因子1α（HIF -1α）/血管内皮生长因子（VEGF ）信号通路有关。
方法 将肺腺癌A549细胞分为黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组，分别加入浓度为200、100、50 µmol /L 的黄芪总皂苷和等体积的二甲基亚砜（DMSO ），培养24 h 。
采用CCK -8法检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blotting 法检测HIF -1α、VEGF 及表皮生长因子受体（EGFR ）蛋白表达。
结果 黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率依次降低，细胞迁移距离依次升高，组间两两比较P 均<0.05。
黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞HIF -1α、VEGF 及EGFR 蛋白相对表达量均依次升高，组间两两比较P 均<0.05。
结论 黄芪总皂苷可降低肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，且随浓度升高而更明显，其机制可能与抑制HIF -1α/VEGF 信号通路有关。
关键词：黄芪总皂苷；肺腺癌细胞；细胞增殖；细胞迁移；细胞凋亡；缺氧诱导因子1α；血管内皮生长因子；表皮生长因子受体doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.003中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1002-266X （2023）23-0011-04Effects of total astragalosides on proliferation ， migration ， apoptosis and HIF -1α/VEGF signaling pathway protein expression of lung adenocarcinoma cells CHEN Jing ， TIAN Weiping ， WEI XiaobaiDepartment of Oncology ， Jing'an District Central Hospital ， Shanghai 200040， ChinaAbstract ： Objective To investigate the effects of total astragalosides on the proliferation ， migration and apoptosis of lung adenocarcinoma cells and whether the mechanism is related to the hypoxia -inducing factor 1α （HIF -1α）/vascular endothelial growth factor （VEGF ） signaling pathway. Methods Lung adenocarcinoma A549 cells were divided into the high -dose ， medium -dose and low -dose total astragalosides groups and control group ， which were added with 200， 100 and50 µmol /L total astragalosides and equal volume of dimethyl sulfoxide （DMSO ）， respectively ， and were cultured for 24 h. Cell proliferation capacity was determined by CCK -8 assay ， cell migration capacity was determined by scratch assay ，apoptosis rate was determined by flow cytometry ， and the expression levels of HIF -1α， VEGF and epidermal growth factor receptor （EGFR ） protein were determined by Western blotting. Results The inhibition rates of cell proliferation and apoptosis rates in the high -dose ， medium -dose and low -dose total astragalosides groups and control group decreased succes⁃sively ， while the cell migration distance increased successively ， with statistically significant differences between groups （all P <0.05）. The relative expression levels of HIF -1α， VEGF and EGFR protein in the high -dose ， medium -dose andlow -dose total astragalosides groups and control group increased successively ， with statistically significant differences be⁃tween groups （all P <0.05）. Conclusion Total astragalosides can reduce the proliferation and migration of lung adeno⁃carcinoma cells ， and induce their apoptosis ， which is more significant with the increase of concentration ， and its mecha⁃nism may be related to the inhibition of HIF -1α/VEGF signaling pathway.Key words ： total astragalosides ； lung adenocarcinoma cells ； cell proliferation ； cell invasion ； apoptosis ； hypoxia -inducible factor -1α； vascular endothelial growth factor ； epidermal growth factor receptor基金项目：国家自然科学基金资助项目（81903860）。
缺氧诱导因子1在急性肺损伤中的研究进展
㊃综 述㊃缺氧诱导因子1在急性肺损伤中的研究进展林红卫 金发光第四军医大学附属唐都医院呼吸与危重症医学科,西安710000通信作者:金发光,E m a i l j i n f a g@f mm u e d u c n ʌ摘要ɔ 急性肺损伤(A L I )是由各种肺内和肺外致伤因素所致的急性低氧性呼吸功能不全,每年造成全世界数以万计的成人和儿童死亡,给患者个人和社会带来了极大的医疗负担㊂缺氧诱导因子1(H I F -1)是调节细胞缺氧应答的关键转录因子,是许多氧依赖性生理和病理生理过程的核心成分㊂大量研究证实,H I F -1与A L I 的发展过程密切相关,且可以作为A L I 的潜在治疗靶点㊂本文就H I F -1在A L I 中的最新研究进展作一综述㊂ʌ关键词ɔ 急性肺损伤;缺氧诱导因子1D O I 10 3760 c m a ji s s n 1673-436X 2019 24 009A d v a n c e m e n t o f p a t h o l o g i c a l r o l e o f h y p o x i a -i n d u c i b l e f a c t o r 1i na c u t e l u n g i n j u r yL i n H o n g w e i J i nF a g u a n gD e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y a n d C r i t i c a lC a r e M e d i c i n e T a n g d u H o s p i t a l t h eF o u r t h M i l i t a r y M e d i c a lU n i v e r s i t yX i 'a n710000 C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r J i nF a g u a n g E m a i l j i n f a g @fmm u e d u c n ʌA b s t r a c t ɔ A c u t e l u n g i n j u r y A L I i s a n a c u t e h y p o x i c r e s p i r a t o r y i n s u f f i c i e n c y a r i s i n g fr o m v a r i o u s i n t r a p u l m o n a r y a n de x t r a p u l m o n a r y i n j u r i e s c o n s e q u e n t l y r e s u l t i n g i ns i g n i f i c a n tm o r b i d i t ya n dm o r t a l i t y a n da g l ob a ld i s e a s eb u r d e n H y p o x i a -i n d uc i b l ef a c t o r1 H I F -1 i sa ni m po r t a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e g u l a t i n g v a r i o u sh y p o x i a -i n d u c e d c e l l u l a r r e s p o n s e s a n d p l a ys ad o m i n a n t r o l e i nv a r i o u so x y g e n -d e p e n d e n t p h y s i o l o g i c a la n d p a t h o p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s A l a r g en u m b e ro f e v i d e n c e sh a v e d e m o n s t r a t e d a n i m p o r t a n t r o l e o fH I F -1i n t h e p a t h o g e n e s i s o fA L I i n d i c a t i n g H I F -1a s a p o t e n t i a l t h e r a p e u t i c t a r g e t f o rA L I T h i s p a p e r r e v i e w s t h e l a t e s t r e s e a r c h p r o gr e s so n H I F -1i n t h e p a t h o ge n e s i s o fA L I ʌK e y wo r d s ɔ A c u t e l u n g i n j u r y H y p o x i a -i n d u c i b l e f a c t o r 1D O I 10 3760 c m a ji s s n 1673-436X 2019 24 009急性肺损伤(a c u t e l u n g i n j u r y ,A L I )是由各种肺内和肺外致伤因素所致的急性低氧性呼吸功能不全㊂目前虽然特殊I C U 和肺保护性机械通气策略已经出现,神经肌肉阻滞剂和干细胞治疗正在开发中,但很少有其他方法在A R D S 的治疗中被证明是有效的,这仍然是一个亟待解决的临床问题,迫切需要进一步研究A L I /A R D S 的发病机制,发展判断疾病严重程度㊁治疗反应和预后的生物标志物㊂缺氧诱导因子1(h y p o x i a -i n d u c i b l ef a c t o r1,H I F -1)是调节细胞缺氧应答的关键转录因子,是许多氧依赖性生理和病理生理过程的核心成分㊂A L I 导致缺氧的发生,而缺氧也是调控H I F -1的主要因素之一㊂实验研究发现,H I F -1途径与A L I 密切相关㊂近年来,关于H I F -1与A L I 的研究逐渐成为一个热点㊂1 A L I1 1 概述 A L I 和更严重[氧合指数<200mmH g(1mmH g =0 133k P a )]的A R D S 是急性全身炎症过程的肺部表现,临床表现为双侧肺浸润和严重的低氧血症㊂A L I /A R D S 的病因很多,包括但不限于感染㊁创伤㊁药物效应㊁脓毒血症㊁摄入物㊁吸入物㊁淹溺㊁休克㊁急性嗜酸粒细胞肺炎㊁呼吸机使用㊁免疫介导的肺出血和血管炎以及放射性肺炎㊂A R D S 的总发病率尚不清楚,据报道每年每10万人中约有2~8例A R D S ;A L I 则更为常见,每年每10万人中约有25例[1]㊂另有文献报道,在美国每年大约有15万人被诊断为A R D S [2]㊂A L I 和A R D S 主要发生在年轻㊁以前体健的人群中,每年造成全世界数以万计的成人和儿童死亡,给患者个人和社会带来了极大的负担㊂据统计,A R D S 的病死率一直保持在40%左右[3]㊂1 2 A L I 的发病机制 A L I 和A R D S 的发展和严重程度与肺泡巨噬细胞活化后中性粒细胞向肺部迁移密切相关[4]㊂同时肺泡上皮和中性粒细胞释放趋化因子(如C X C L -8㊁㊃5881㊃国际呼吸杂志2019年12月第39卷第24期 I n t JR e s p i r ,D e c e m b e r 2019,V o l .39,N o .24Copyright ©博看网. All Rights Reserved.E N A-78)㊁促炎细胞因子[如I L-1㊁I L-6㊁肿瘤坏死因子α(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-α,T N F-α)]㊁急性期反应物(如C 反应蛋白)和基质金属蛋白酶(如基质金属蛋白酶9),过度的中性粒细胞炎症会导致肺泡上皮细胞外基质破坏和通透性增加,损伤肺泡-毛细血管屏障[5-6],引起非心源性肺水肿的发展㊂T a k e u c h i和A k i r a[7]的研究表明模式识别受体在A L I过程中可启动炎症信号级联效应,释放T N F-α㊁I L-8等促炎细胞因子,同时刺激细胞凋亡或自噬㊂在一项小鼠研究中,T o l l样受体(T o l l-l i k er e c e p t o r s,T L R s)信号通路已被证明参与A R D S的发展过程,组织损伤后产生的透明质酸降解产物与T L R4和T L R2相互作用,能够诱导A L I的炎症反应,该研究还报道了肺上皮细胞中高分子量透明质酸的过表达对肺损伤和细胞凋亡具有保护作用[8]㊂此外,补体的血管内活化可导致中性粒细胞活化㊁隔离并黏附于肺毛细血管内皮,导致血管内皮细胞损伤坏死和A L I㊂肺泡内补体的激活可导致补体和中性粒细胞依赖的A L I,引发细胞因子或趋化因子风暴,加重A L I[9]㊂值得注意的是,A R D S的后续过程是可变的㊂部分患者肺泡水肿液再吸收,肺泡上皮损伤区域修复,临床呼吸衰竭恢复㊂其他患者肺泡水肿持续,随后逐渐出现肺泡内纤维化和瘢痕[10]㊂2H I F-121概述H I F-1最初是由S e m e n z a和W a n g[11]在1992年研究缺氧诱导的促红细胞生成素基因表达时从细胞核中提取出的一种蛋白质,广泛存在于机体细胞中㊂目前H I F-1作为调节细胞对氧张力变化反应的主要转录因子被广泛共识[12]㊂H I F-1调节参与能量代谢㊁增殖和细胞外基质重组的基因,从而影响血管张力的调节㊁缺血性心血管功能障碍㊁低氧性肺动脉高压㊁肿瘤的发生和发展㊁糖和能量的代谢㊁铁的代谢㊁休克及炎症等生理和病理生理过程㊂22H I F-1的结构与活性调节H I F-1是一种异源二聚体,由功能亚基H I F-1α和被称为芳香烃受体核转运蛋白的结构亚基H I F-1β组成[13]㊂H I F-1α活性亚基的C末端含有2个反式激活结构域㊁1个富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸的氧依赖性降解区以及1个抑制域㊂H I F-1有2种转录共激活因子:C R E B结合蛋白和p300,这2种转录共激活因子与反式激活结构域的相互作用是转录激活的必要条件[14]㊂H I F-1β亚基在细胞内比较稳定,H I F-1α亚基的稳定性随细胞内氧含量的变化而波动,其机制与P H D s-H I F s-p V H L 通路密切相关㊂脯氨酸羟化酶(p r o l y l h y d r o x y l a s ed o m a i n p r o t e i n s,P H D s)是一类F e2+依赖性㊁以氧分子为底物的蛋白质,目前只有P H D1㊁P H D2㊁P H D3参与H I F-1α的羟基化作用㊂在常氧条件下,P H D s用氧分子羟化H I F-1α亚基中的2个脯氨酸残基,羟基化的脯氨酸残基被希佩尔㊃林道病肿瘤抑制蛋白/E3泛素-连接酶复合物识别,导致H I F-1α亚基进行蛋白酶体途径水解[15]㊂在缺氧条件下,没有足够的氧气供P H D s羟化H I F-1α亚基,H I F-1α亚基不能被希佩尔㊃林道病肿瘤抑制蛋白识别和进一步降解,从而保持其含量的稳定性㊂H I F-1α进入细胞核后与H I F-1β结合形成H I F-1异源二聚体,结合目标基因启动子中的缺氧反应原件,从而驱动H I F-1依赖的转录程序[16]㊂23 H I F-1在肺中的生物学效应细胞对氧波动的反应在很大程度上由H I F所介导㊂氧气被吸入后,第一个接触到的器官是肺,但目前对肺H I F-1氧敏感通路的认识比较有限㊂在肺血管方面,B r u s s e l m a n s等[17]的研究表明H I F-1α缺失的杂合子小鼠暴露于慢性缺氧环境中,其肺动脉高压进程受阻,部分原因是肺血管重构受限㊂相反,携带R200W突变V H L的小鼠,因不能有效地降解H I F-1,导致其更容易发生肺动脉高压[18]㊂其次,H I F-1在肺动脉平滑肌细胞的活性与缺氧诱导的肺血管重构密切相关㊂体外培养的肺动脉平滑肌细胞在常氧状态下可以表达H I F-1α信号,而在缺氧状态下H I F-1α信号的表达进一步增强㊂B a l l 等[19]的研究显示他莫昔芬诱导的平滑肌特异性H I F-1缺失可减弱慢性缺氧条件下肺血管重构和肺动脉高压㊂另一项研究显示,当肺动脉平滑肌细胞特异性H I F-1α失活的S M22-C r e小鼠暴露于缺氧状态下,细动脉肌化程度有降低的趋势,且H I F-1α可通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化来减少血管张力[20]㊂关于H I F-1α在气道上皮的作用机制方面, S h e r m a n等[21]的研究证实了在缺氧的Ⅱ型肺泡上皮细胞中,H I F相关通路和炎性小体激活过程中相关蛋白的表达显著增加㊂其次,有研究证实肺神经上皮小体对持续或慢性缺氧的反应与P H D-H I F依赖机制有关㊂在人类和动物模型中,缺氧导致神经上皮小体的增生,P H D1和P H D3被证实参与了这一反应[22]㊂此外,许多关于H I F-1在肺生物学作用的研究都侧重于慢性缺氧方面,因此有必要进一步研究急性缺氧状态下的H I F-1依赖性通路,以探索肺组织中新的氧敏感相关分子和细胞适应性机制㊂3H I F-1与A L I31 H I F-1与A L I的发病机制311 H I F-1与A L I缺氧缺氧是A L I的表现之一,可以导致肺功能和肺损伤修复的失常㊂A L I的早期事件包括毛细血管内皮损伤㊁肺泡上皮细胞的凋亡和肺水肿,而晚期以Ⅱ型肺泡上皮细胞的反应性增生为主,进而导致肺纤维化㊂有研究指出,H I F-1在肺缺血再灌注损伤中可导致肺血管功能障碍[23],而在脑缺血再灌注损伤诱导的肺损伤研究过程中则发现,机体可能通过H I F-1α/血管内皮生长因子信号通路上调抗氧化应激活性,促进血管生成和修复内皮屏障,实现自我保护[24]㊂虽然这些研究都没有测试H I F-1的缺失与检测到的血管通透性变化是否直接相关,但从表面上看,这些结果意味着H I F-1可能同时发挥屏障保护和屏障破坏的作用㊂关于肺泡上皮细胞损伤和随后的肺纤维化,肺挫伤后低氧Ⅱ型肺泡上皮细胞的分子特征表明H I F-1α在其凋亡过程中起着重要作用[21]㊂通过炎症水平的N O上调H I F-1可能是上皮细胞创伤修复受到抑制的原因[25]㊂此外,有研究证实,上皮-间充质转化可以加剧A L I患者肺纤维化[26],这一过程中肺泡上皮细胞中的活性氧可以起到稳定H I F-1α的作用[27]㊂虽然这些研究为H I F 参与A L I的发展提供了间接证据,但H I F-1在肺毛细血管㊃6881㊃国际呼吸杂志2019年12月第39卷第24期I n t JR e s p i r,D e c e m b e r2019,V o l.39,N o.24Copyright©博看网. All Rights Reserved.通透性等方面的作用仍不乏争议,因此目前还需要进一步在多种肺损伤模型中研究H I F-1α,以确定其在A L I中的确切作用㊂312 H I F-1与A L I的炎症反应 A L I过程中存在正反馈的促炎效应,大量的炎症因子会提高H I F-1的表达,而增加的H I F-1又会刺激炎症因子大量释放,放大炎症反应,加重肺损伤㊂L i u等[28]利用海水吸入性肺损伤大鼠模型研究证实,高渗通过激活A TM和P I3K促进H I F-1α的m R N A表达和激活p38抑制H I F-1α的蛋白降解2种方式增加H I F-1α的表达,H I F-1α的表达增加促进大鼠肺泡巨噬细胞(N R8383)中炎症因子的产生,促进大鼠肺组织炎症㊂一项体外研究报道,由脓毒症淋巴液培养的人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)和人肺微血管内皮细胞,其细胞活力显著下降,炎症细胞因子(T N F-α㊁I L-6㊁I L-1)水平升高,利用免疫荧光定位及R T-P C R检测H I F-1的表达被激活[29]㊂这些结果初步表明,脓毒症致急性肺炎症损伤过程是通过H I F-1α依赖途径发生的㊂此外,在A L I中H I F-1也可以作用到具体的炎症因子,发挥促炎作用㊂S u r e s h 等[30]的实验表明,与野生型小鼠相比,Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性H I F-1α条件敲除小鼠肺挫伤后各时间点肺损伤程度均显著降低,促炎细胞因子如I L-1㊁I L-6㊁巨噬细胞炎性蛋白2的释放明显降低,这一过程是通过核转录因子κB介导的,且肺上皮细胞中的H I F-1被证明可以调节I L-1的启动子活性,由此可以推断Ⅱ型肺泡上皮细胞中H I F-1的活化是肺挫伤后急性炎症的主要驱动因素㊂另一项研究显示H I F-1α作用于T N F-α的下游,抑制血管扩张刺激磷蛋白的表达,调节急性肺部炎症过程,这些分子在肺泡-毛细血管屏障的损伤中发挥重要作用[31]㊂32 H I F-1与A L I的治疗321 H I F-1抑制与A L I A L I的缺氧及炎症反应都与H I F-1密切相关㊂实验证据表明,H I F-1参与了A L I的急性期与慢性期的全过程,目前很多研究都致力于通过药物抑制H I F-1途径来治疗A L I㊂阿托伐他汀可以通过下调H I F-1α-连环蛋白通路,降低百草枯中毒诱导的上皮-间充质转化,减轻大鼠百草枯中毒引起的肺损伤和肺纤维化,且这种效应与剂量有关[32]㊂盐酸戊乙奎醚可以抑制H I F-1α㊁I L-1β和I L-6表达水平,减弱大鼠的重症急性胰腺炎相关A L I的严重程度[33]㊂缺血前给予右美托咪定可通过调控P I3K/A k t/H I F-1α信号通路,在大鼠肺缺血再灌注损伤中起到保护作用[34-35]㊂57-二羟基-8-甲氧基黄酮对内毒素诱导的A L I的保护机制与上调抗氧化酶㊁抑制核转录因子κB磷酸化和H I F-1的上调有关[36]㊂丙泊酚通过降低H I F-1α㊁B c l-2/E1B-19k D a相互作用蛋白3和细胞因子的产生,减少脂多糖诱导的大鼠肺上皮细胞凋亡,预防脓毒症所致A L I[37]㊂此外,一些传统中草药也被证明可以通过抑制H I F-1途径治疗A L I㊂大花红景天萃取物通过下调H I F-1α的靶基因血浆内皮素1和血管内皮生长因子的水平,保持肺泡-毛细血管屏障的完整性,减轻高原肺水肿[38]㊂丹参㊁白藜芦醇等也被证明可以通过抑制H I F-1途径来治疗A L I[39-41],这为传统中医药治疗A L I提供了科学依据,同时在A L I的药物治疗方面提供了新的研究思路㊂322 H I F-1在A L I中的保护作用虽然目前大多数研究都证实可以通过抑制H I F-1途径减轻A L I,但在一些研究中,H I F-1却被发现可以在多种病因导致的A L I中起到保护作用㊂骨髓间充质干细胞可以在损伤肺组织内分化为肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞,增加肺泡表面活性物质的分泌,减少炎症反应,抑制炎症介质的释放㊂百草枯中毒后肺组织中H I F-1α的表达上调,通过血管内皮生长因子的介导对骨髓间充质干细胞发挥显著的增殖动员作用[42]㊂在脂多糖联合急性缺氧诱导A L I大鼠模型中,缺氧可通过激活肺泡巨噬细胞T L R4信号通路加重A L I炎症,靶向上调H I F-1α可以抑制T L R4基因启动子活性,从而抑制T L R4表达和巨噬细胞炎症,提示H I F-1α与T L R4的交互作用通路在A L I中的潜在治疗和预防价值[43]㊂E c k l e 等[44]报道了H I F-1α通过优化肺泡上皮碳水化合物代谢来减轻A L I㊂M a g n a n i等[45]报道了H I F-1介导的蛋白激酶C z e t a降解可以稳定质膜钠钾A T P酶,以防止缺氧引起的肺损伤㊂这些研究揭示了H I F-1在A L I期肺保护中的惊人作用,为研究H I F-1与A L I的治疗提供了另一个重要的方向㊂4结语A L I与A R D S的病理生理学表现为过度炎症反应,通过破坏肺泡-毛细血管屏障导致富含蛋白的肺水肿液积聚, H I F-1是这些过程中的重要参与者,且参与过程是复杂的,尤其是关于H I F-1在肺血管渗漏方面的作用还存在争议㊂此外,进一步阐明H I F-1在肺多种氧敏感通路中的作用,探索肺泡上皮细胞的凋亡机制都可能成为下一步研究的方向㊂在A L I的治疗方面,虽然目前大多数研究都证实可以通过抑制H I F-1途径减轻A L I,但在肺挫伤㊁移植和其他肺损伤的病例中却发现,H I F-1的升高对恢复和生存是有利的[14],这些都为H I F-1在A L I乃至危重症医学治疗中的应用提供了新思路㊂总之,更全面深入地了解H I F-1在A L I/A R D S中的作用,有助于更好地理解这种常见肺部疾病的发病机制,并为新的治疗方法提供新的靶点和预后生物标志物㊂利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1 P a r e k hD D a n c e rR C T h i c k e t tD R A c u t el u n g i n j u r y JC l i n M e d L o n d2011116615-618D O I107861c l i n m ed i c i n e11-6-6152 B u t tY K u r d o w s k aA A l l e nT C A c u t e l u n g i n j u r y a c l i n i c a la n dm o l e c u l a rr e v i e w J A r c h P a t h o lL ab M e d20161404345-350D O I105858a r p a2015-0519-R A3S p a d a r oS P a r k M T u r r i n iC e ta l B i o m a r k e r sf o ra c u t er e s p i r a t o r y d i s t r e s ss y n d r o m ea n d p r o s p e c t s f o r p e r s o n a l i s e dm e d i c i n e J J I n f l a mm L o n d2019161D O I101186s12950-018-0202-y4 W i l l i a m s A E C h a m b e r s R C T h e m e r c u r i a l n a t u r e o f㊃7881㊃国际呼吸杂志2019年12月第39卷第24期I n t JR e s p i r,D e c e m b e r2019,V o l.39,N o.24Copyright©博看网. All Rights Reserved.n e u t r o p h i l s s t i l l a n e n i g m a i nA R D S J A mJ P h y s i o l L u n gC e l lM o lP h y s i o l20143063L217-L230D O I101152a j p l u n g0031120135 O'K a n eC M M c K e o w n S W P e r k i n s G D e ta l S a l b u t a m o lu p-r e g u l a t e sm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e-9i nt h ea l v e o l a r s p a c ei n t h e a c u t e r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e J C r i t C a r eM e d20093772242-2249D O I101097C C M 0b013e3181a5506c6 N a t h a n iN P e r k i n s G D T u n n i c l i f f e W e t a l K e r b s v o nL u n g r e n6a n t i g e ni sa m a r k e ro f a l v e o l a r i n f l a mm a t i o nb u t n o to fi n f e c t i o ni n p a t i e n t s w i t h a c u t er e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e J C r i tC a r e2008121R12D O I101186c c67857 T a k e u c h i O A k i r a S P a t t e r n r e c o g n i t i o n r e c e p t o r s a n di n f l a mm a t i o n J C e l l20101406805-820D O I101016j c e l l2010010228J i a n g D L i a n g J F a nJ e ta l R e g u l a t i o no f l u n g i n j u r y a n d r e p a i r b y T o l l-l i k er e c e p t o r sa n dh y a l u r o n a n J N a t M e d200511111173-1179D O I101038n m13159 B o s m a n n M W a r d P A R o l eo fC3C5a n da n a p h y l a t o x i nr e c e p t o r s i na c u t e l u n g i n j u r y a n d i n s e p s i s J A d vE x p M e dB i o l2012946147-159D O I101007978-1-4614-0106-3_910 F a n e l l iV R a n i e r iVM M e c h a n i s m s a n d c l i n i c a l c o n s e q u e n c e so f a c u t e l u n g i n j u r y J A n nA m T h o r a cS o c201512S u p p l 1S3-S8D O I101513A n n a l s A T S201407-340M G11S e m e n z aG L W a n g G L An u c l e a r f a c t o r i n d u c e db y h y p o x i a v i a d e n o v o p r o t e i n s y n t h e s i s b i n d s t o t h e h u m a ne r y t h r o p o i e t i n g e n e e n h a n c e r a t a s i t e r e q u i r e df o rt r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n J M o lC e l lB i o l199212125447-5454D O I101128m c b1212544712S u r e s h MV B a l i j e p a l l iS Z h a n g B e ta l H y p o x i a-i n d u c i b l ef a c t o r H I F-1αp r o m o t e s i n f l a mm a t i o na n d i n j u r y f o l l o w i n ga s p i r a t i o n-i n d u c e dl u n g i n j u r y i n m i c e J S h o c k2018I np r e s s D O I101097S H K 000000000000131213 W a n g G L J i a n g B H R u eE A e t a l H y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r1i sa b a s i c-h e l i x-l o o p-h e l i x-P A S h e t e r o d i m e rr e g u l a t e d b yc e l l u l a rO2t e n s i o n J P r o cN a t lA c a dS c iU S A 199592125510-5514D O I101073p n a s9*******14 B o g d a n o v s k i D A D i F a z i o L T B o g d a n o v s k i A K e t a lH y p o x i a-i n d u c i b l e-f a c t o r-1i nt r a u m aa n dc r i t i c a lc a r e J JC r i tC a r e201742207-212D O I101016j j c r c20170702915I v a nM K o n d oK Y a n g H e t a l H I F a l p h a t a r g e t e d f o rV H L-m e d i a t e dd e s t r u c t i o n b y p r o l i n eh y d r o x y l a t i o n i m p l i c a t i o n sf o rO2s e n s i ng J S c i e n c e20012925516464-468D O I101126s c i e n c e105981716S e m e n z a G L H y p o x i a-i n d u c i b l ef a c t o r si n p h y s i o l o g y a n d m e d i c i n e J C e l l20121483399-408D O I101016jc e l l20120102117 B r u s s e l m a n sK C o m p e r n o l l eV T j w a M e t a l H e t e r o z y g o u sd e f i c i e n c y o fh y p o x i a-i n d u c i b l ef a c t o r-2a l p h a p r o t e c t s m i c ea g a i n s t p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o n a n d r i g h t v e n t r i c u l a rd y s f u n c t i o n d u r i n g p r o l o n ge d h y p o x i a J J C l i n I n v e s t2003111101519-1527D O I101172J C I1549618S m i t hT G B r o o k sJ T B a l a n o s GM e ta l M u t a t i o no fv o nH i p p e l-L i n d a u t u m o u r s u p p r e s s o r a n d h u m a nc a rd i o p u l m o n a r y p h y s i o l o g y J P L o S Me d200637e290D O I101371j o u r n a l p m e d003029019 B a l lMK W a y p aG B M u n g a i P T e t a l R e g u l a t i o n o f h y p o x i a-i n d u c e d p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o nb y v a s c u l a rs m o o t h m u s c l eh y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r-1αJ A mJR e s p i rC r i tC a r e M e d20141893314-324D O I101164r c c m 201302-0302O C20 K i m YM B a r n e s E A A l v i r a C M e ta l H y p o x i a-i n d u c i b l ef a c t o r-1αi n p u l m o n a r y a r t e r y s m o o t h m u s c l ec e l l sl o w e r sv a s c u l a r t o n e b y d e c r e a s i n g m y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n J C i r cR e s201311291230-1233D O I101161C I R C R E S A HA 11230064621S h e r m a n MA S u r e s h MV D o l g a c h e v V A e ta l M o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no f h y p o x i ca l v e o l a r e p i t h e l i a l c e l l sa f t e r l u n gc o n t u s i o ni nd i c a te sa ni m p o r t a n tr o l ef o r H I F-1αJ A n nS u r g2018 2672 382-391 D O I 10 1097S L A 000000000000207022 P a n J B i s h o p T R a t c l i f f e P J e t a l H y p e r p l a s i a a n dh y p e r t r o p h y o f p u l m o n a r y n e u r o e p i t h e l i a lb o d i e s p r e s u m e da i r w a y h y p o x i a s e n s o r s i n h y p o x i a-i n d u c ib l ef ac t o r p r o l y lh y d r o x y l a s e-d e f i c i e n tm i c e J H y p o x i a A u c k l2016469-80D O I102147H P S10395723 Z h a oX J i n Y L iH e ta l H y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r1a l p h ac o n t r i b u t e s t o p u l m o n a r y v a s c u l a rd y s f u n c t i o n i n l u n gi s c h e m i a-r e p e r f u s i o n i n j u r y J I n t JC l i nE x p P a t h o l2014763081-308824 F a n J L v H L i J e ta l R o l e so fN r f2H O-1a n d H I F-1αV E G Fi nl u n g t i s s u ei n j u r y a n dr e p a i rf o l l o w i n g c e r e b r a li s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n j u r y J JC e l l P h y s i o l201923467695-7707D O I101002j c p2776725 B o v eP F H r i s t o v a M W e s l e y U V e t a l I n f l a mm a t o r y l e v e l so fn i t r i c o x i d ei n h i b i ta i r w a y e p i t h e l i a lc e l l m i g r a t i o n b yi n h i b i t i o no f t h ek i n a s eE R K12a n da c t i v a t i o no fh y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r-1a l p h a J J B i o lC h e m 20082832617919-17928D O I101074j b c M70991420026 G o u d a MM S h a i k h S B B h a n d a r y Y P I n f l a mm a t o r y a n df i b r i n o l y t i c s y s t e mi n a c u t e r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e JL u n g20181965609-616D O I101007s00408-018-0150-627S c h r o e d l C M c C l i n t o c kD S B u d i n g e rG R e t a l H y p o x i cb u t n o t a n o x i c s t a b i l i z a t i o no fH I F-1a l p h a r e q u i r e sm i t o c h o n d r i a l r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s J A m J P h y s i o lL u n g C e l l M o l P h y s i o l20022835L922-L931D O I101152a j p l u n g00014200228 L i uZ Z h a n g B W a n g X B e t a l H y p e r t o n i c i t y c o n t r i b u t e s t os e a w a t e r a s p i r a t i o n-i n d u c e d l u n g i n j u r y r o l e o f h y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r1αJ E x p L u n g R e s2015416301-315D O I103109019021482015103080329S u nH D L i uY J C h e nJ e t a l T h e p i v o t a l r o l eo fH I F-1αi n l u n g i n f l a mm a t o r y i n j u r y i n d u c e db y s e p t i cm e s e n t e r i c l y m p hJ B i o m e dP h a r m a c o t h e r201791476-484D O I101016㊃8881㊃国际呼吸杂志2019年12月第39卷第24期I n t JR e s p i r,D e c e m b e r2019,V o l.39,N o.24Copyright©博看网. All Rights Reserved.j b i o p h a20170410330S u r e s h MV R a m a k r i s h n a nS K T h o m a s B e t a l A c t i v a t i o n o fh y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r-1αi n t y p e2a l v e o l a r e p i t h e l i a l c e l l i sam a j o r d r i v e r o f a c u t e i n f l a mm a t i o n f o l l o w i n g l u n g c o n t u s i o nJ C r i tC a r eM e d2*******e642-e653D O I101097C C M 000000000000048831 T a n g M T i a nY L i D e t a l T N F-αm e d i a t e d i n c r e a s e o fH I F-1αi n h i b i t sV A S Pe x p r e s s i o n w h i c h r e d u c e s a l v e o l a r-c a p i l l a r yb a r r i e r f u nc t i o nd u r i n g a c u t el u n g i n j u r y A L I J P L o SO n e201497e102967D O I101371j o u r n a l p o n e010296732 D u J Z h uY M e n g X e t a l A t o r v a s t a t i na t t e n u a t e s p a r a q u a tp o i s o n i n g-i n d u c e d e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n v i ad o w n re g u l a t i n g h y p o x i a-i n d u c i b l ef a c t o r-1a l p h a J L i f eS c i2018213126-133D O I101016j l f s20181002633 Z h u R Z h a o Y L i X e t a l E f f e c t s o f p e n e h y c l i d i n eh y d r o c h l o r i d eo n s e v e r ea c u t e p a n c r e a t i t i s-a s s o c i a t e d a c u t el u n g i n j u r y i n r a t s J B i o m e dP h a r m a c o t h e r2018971689-1693D O I101016j b i o p h a20171202534 Z h a n g W Z h a n g J Q M e n g F M e t a l D e x m e d e t o m i d i n ep r o t e c t s a g a i n s t l u n g i s c h e m i a-r e p e r f u s i o n i n j u r y b y t h e P I3K A k t H I F-1αs i g n a l i n gp a t h w a y J JA n e s t h2016305826-833D O I101007s00540-016-2214-135 L i a n g S W a n g Y L i u Y D e x m e d e t o m i d i n ea l l e v i a t e sl u n gi s c h e m i a-r e p e r f u s i o ni n j u r y i nr a t sb y a c t i v a t i n g P I3K A k tp a t h w a y J E u rR e v M e dP h a r m a c o lS c i2019231370-377D O I1026355e u r r e v_201901_1678536S u n H L P e n g M L L e eS S e ta l E n d o t o x i n-i n d u c e da c u t e l u n g i n j u r y i n m i c e i s p r o t e c t e d b y57-d i h y d r o x y-8-m e t h o x y f l a v o n e v i a i n h i b i t i o no f o x i d a t i v e s t r e s s a n d H I F-1αJ E n v i r o n T o x i c o l201631121700-1709D O I101002t o x2217237 Y e h C H C h o W S o E C e t a l P r o p o f o l i n h i b i t sl i p o p o l y s a c c h a r i d e-i n d u c e d l u n g e p i t h e l i a l c e l l i n j u r y b y r e d u c i n g h y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r-1a l p h ae x p r e s s i o n J B rJA n a e s t h20111064590-599D O I101093b j a a e r00538 L e eS Y L i MH S h iL S e ta l R h o d i o l ac r e n u l a t ae x t r a c ta l l e v i a t e sh y p o x i c p u l m o n a r y e d e m ai nr a t s J E v i d B a s e dC o m p l e m e n t A l t e r n a t M e d20132013718739D O I101155201371873939 M aL Z h a o Y L iB e ta l354'-T r i-O-a c e t y l r e s v e r a t r o la t t e n u a t e s s e a w a t e r a s p i r a t i o n-i n d u c e d l u n g i n j u r yb yi n h i b i t i n g a c t i v a t i o no fn u c l e a rf a c t o r-k a p p aBa n dh y p o x i a-i n d u c i b l e f a c t o r-1αJ R e s p i rP h y s i o lN e u r o b i o l20131853608-614D O I101016j r e s p20121101640 M aL Z h a oY W a n g R e t a l354'-T r i-O-a c e t y l r e s v e r a t r o la t t e n u a t e s l i p o p o l y s a c c h a r i d e-i n d u c e d a c u t e r e s p i r a t o r yd i s t re s s s y n d r o m e v i a MA P K S I R T1p a t h w a y J M e d i a t o r sI n f l a mm 20152015143074D O I101155201514307441 X u M C a o F L Z h a n g Y F e t a l T a n s h i n o n e I I At h e r a p e u t i c a l l y r e d u c e s L P S-i n d u c e d a c u t el u n g i n j u r y b yi n h i b i t i n g i n f l a mm a t i o n a n d a p o p t o s i si n m i c e J A c t aP h a r m a c o lS i n2015362179-187D O I101038a p s201411242刘泽岩程景林戚金威等低氧诱导因子1α干预诱导骨髓间充质干细胞增殖治疗百草枯中毒后肺损伤J国际免疫学杂志201841113-18D O I103760c m a j i s s n1673-439420180100343 W u G X u G C h e n D W e t a l H y p o x i a e x a c e r b a t e si n f l a mm a t o r y a c u t el u n g i n j u r y v i at h et o l l-l i k er e c e p t o r4s i g n a l i n gp a t h w a y J F r o n tI mm u n o l201891667D O I103389f i mm u20180166744 E c k l eT B r o d s k y K B o n n e y M e ta l H I F1Ar e d u c e sa c u t el u n g i n j u r y b y o p t i m i z i n g c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m i nt h ea l v e o l a re p i t h e l i u m J P L o S B i o l2013119e1001665D O I101371j o u r n a l p b i o100166545 M a g n a n iN D D a d aL A Q u e i s s e r MA e t a l H I Fa n d H O I L-1L-m e d i a t e dP K Cζd e g r a d a t i o ns t a b i l i z e s p l a s m a m e m b r a n e N a K-A T P a s e t o p r o t e c t a g a i n s t h y p o x i a-i n d u c e d l u n g i n j u r yJ P r o c N a t l A c a d S c i U S A 201711447E10178-E10186D O I101073p n a s1713563114收稿日期2019-03-26㊃9881㊃国际呼吸杂志2019年12月第39卷第24期I n t JR e s p i r,D e c e m b e r2019,V o l.39,N o.24Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春【摘要】目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-H IF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.%Objective To establish the A549 cell line with stable expression of HIF1α by using lentiviral vector system.Methods Primers were designed and synthesized with human HIF1α gene coding sequence by the National Center of Biotechnogical Information(NCBI) as the template.HIF1α was amplified by PCR.The HIF1α fragment recycled by enzyme digestion was recombined with prepared lentiviral vector HBLV-RFP-Puro.The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing.The recombinant plasmid and the auxiliary plasmid were co-transfect into 293T cell.After filtration and concentration of packaged virus,the viral titer was detected by using the dilution counting method.The prepared lentivirus was infected A549 cells.The drug screening was adopted to stabilize the transfected cellline.The transfection effect was detected and observed by fluorescence microscope and Western blotting.Results The HIF1α fragment amplified by PCR was successfully verified and the recombinant plasmid was successfully constructed by PCR and gene sequencing identification.High-titer LV-HIF1α was obtained by successful package.After LV-HIF1α infecting A549 cells,the cells showed the red fluorescence by fluorescence microscope.The expression level of HIF1α in the LV-HIF1α group was significant higher than that in the control group by Westernblot.Conclusion The 549 cell line with HIF1α stable expression mediated by lentivirus is constructed successfully.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2017(046)020【总页数】4页(P2744-2746,2750)【关键词】HIF1α;慢病毒载体;稳定表达;A549【作者】邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春【作者单位】南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心血管内科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其导致的死亡人数居各类恶性肿瘤之首[1]。
A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移
CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.44 No.1 2021 解剖学杂志 2021年第44卷第1期A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移*姜杨1王璐璐1金海峰1姚立杰1张嵩2刘丹阳3李永涛1张善强1沈雷1△（齐齐哈尔医学院，1 解剖学教研室，2 细胞生物学教研室，3 组织学胚胎学教研室，齐齐哈尔 161006）摘要目的：探讨A549肺癌细胞对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖和运动的影响。
方法：以提取A549肺癌细胞和BEAS-2B正常人肺上皮细胞上清液制备条件培养基，培养的hBMSCs分别为A549组和BEAS-2B组；2组均添50 nmol/L趋化因子-8（CXCL-8），分别为A549 C组和BEAS-2B C组，若同时添加100 nmol/L triciribine （Akt抑制剂）分别为A549 CT组和BEAS-2B CT组；A549组加入100 nmol/L triciribine为A549 T组。
正常条件下培养的hBMSCs为对照组。
ELISA检测细胞上清液中CXCL-8含量和hBMSCs裂解液Akt、P-Akt蛋白的表达。
MTT实验、流式细胞仪和transwell细胞小室实验分别检测各组hBMSCs吸光度值（A490值）、细胞凋亡率和细胞迁移数目。
结果：与BEAS-2B上清液相比，A549上清液中CXCL-8含量明显升高。
各组hBMSCs的A490值、细胞凋亡率、细胞迁移数目、Akt和P-Akt蛋白表达等均具有显著差异，尤以A549 C组hBMSCs最明显。
与A549 C 组相比，A549 CT组hBMSCs的A490值和细胞迁移数目、Akt和P-Akt蛋白表达均降低，细胞凋亡率升高较显著。
结论：A549细胞表达的CXCL-8能激活Akt通路，促进hBMSCs增殖和运动。
关键词趋化因子-8；人骨髓间充质干细胞；Akt信号通路；细胞迁移Conditioned media prepared from A549 lung carcinoma cells promotes the proliferation and migration of human bone marrow mesenchymal stem cells*Jiang Yang1， Wang Lulu1， Jin Haifeng1， Yao Lijie1， Zhang Song2， Liu Danyang3，Li Yongtao1， Zhang Shanqiang1， Shen Lei1△（1. Department of Anatomy，2. Department of Cell Biology，3. Department of Histology and Embryology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China）Abstract Objective：To investigate the effect of A549 cells （lung carcinoma cells） on the proliferation and migration of human bone marrow mesenchymal stem cells （hBMSCs）. Methods： The supernatants of A549 cells and BEAS-2B cells （the normal human bronchial epithelial cell line）were extracted. hBMSCs cultured with the supernatants were called A549 group and BEAS-2B group respectively； 50 nmol/L chemokine-8 （CXCL-8）was added to both groups to form A549 C group and BEAS-2B C group； 100 nmol/L triciribine （Akt inhibitor） was added at the same time to form A549 CT group and BEAS-2B CT group； 100 nmol/L triciribine was added to A549 group to form A549 T group. hBMSCs incubated in the conventional condition were served as the control group. The CXCL-8 in the cell culture supernatants and the expression of Akt and P-Akt in hBMSCs lysates were tested by ELISA. MTT assay， flow cytometry and transwell assay were used to detect the absorbance （A490）， apoptosis rate and the number of migrating cells in each group respectively. Results： Compared with the BEAS-2B supernatant， the CXCL-8 in the A549 supernatant was significantly increased. There were significant differences in A490， apoptosis rate， the number of migrating cells， and Akt and P-Akt expressions of hBMSCs in each group， especially in A549 C group. Compared with the A549 C group， the A490 and the number of migrating cells， Akt and P-Akt expression of hBMSCs in the A549 CT group were reduced， but the apoptosis rate was increased significantly. Conclusion： CXCL-8 expressed by A549 cells can activate the Akt pathway and promote the proliferation and migration of hBMSCs.Key words C-X-C motif chemokine ligand-8；human bone marrow mesenchymal stem cell； Akt signaling pathway； cell migrationdoi： 10.3969/j.issn.1001-1633.2021.01.003·论 著·* 黑龙江省卫生健康委员会科研课题（2018470）第1作者 E-mail：*****************.cn△通信作者，E-mail：******************.cn收稿日期：2020-04-09；修回日期：2020-09-09间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌发生的因素之一[1]。
Erastin在铁死亡中的作用
Erastin在铁死亡中的作用铁死亡是近几年新发现的一种细胞死亡方式，以铁依赖性脂质过氧化物累积为主要特征［1］。
铁死亡诱导剂主要有两大类：第一类包括Erastin,柳氮磺胺毗口定、谷氨酸盐等，可通过systemXC■发挥作用；第二类包括RSL3、DP17等，可直接抑制谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性起作用［2］。
其中，Erastin与其他铁死亡诱导剂通常介导单一通路不同，它可以介导多种分子，而且作用效果高效、迅速、持久［3］。
本文就Erastin的作用通路及抗肿瘤的特点进行综述。
1 Erastin的发现Dolma等［4］在2003年发现一种小分子化合物，能够选择性杀死表达ST和RAS的工程肿瘤细胞，将其命名为Erastin o然而，与喜树碱可诱导表达ST和RAS的细胞凋亡不同，被EraStin 诱导死亡的细胞中，未发现线粒体细胞色素c的释放、Caspase-3的激活、DNA片段化等凋亡经典特征，并且这种死亡方式不能被凋亡抑制剂抑制［4,5,6］。
因此，EraStin所诱导的是一种新型的、非凋亡的细胞死亡形式⑼。
根据其特点，Dixon等［1］在2012年将Erastin诱导的细胞死亡方式命名为铁死亡。
2铁死亡的特征及相关通路1.1 铁死亡的概念及特征铁死亡是一种表现为铁依赖性的、细胞内脂质活性氧（L-ROS）累积的细胞死亡形式。
铁死亡与其他细胞死亡方式（如细胞凋亡、坏死、自噬等）在诸多方面均存在显著差异。
在形态学方面，铁死亡细胞表现为特有的线粒体皱缩和线粒体膜密度增加，而其他形式细胞死亡的典型特征在铁死亡中均不会出现［1,7］。
在生化代谢方面，铁死亡细胞内氧化还原稳态被打破，抗氧化能力降低，细胞内活性氧升高。
同时，这种死亡过程可以被抗氧化剂和铁螯合剂所抑制［1］。
尽管诱导铁死亡的上游通路有多个，最终都会直接或间接导致细胞内L-ROS生成与降解平衡失调，L-ROS增多，发生铁死亡［1,8］。
1.2 通过抑制胱氨酸-谷氨酸转运受体systemXC■诱导铁死亡SyStemXe-是一种反向转运蛋白，由SLC7A11和SLC3A2亚基组成，可将谷氨酸转出细胞的同时将胱氨酸转入细胞［9］。
缺氧诱导因子(HIF-1)与炎症关系的研究进展
缺氧诱导因子(HIF-1)与炎症关系的研究进展机体的生长发育与代谢活动需要体内氧气的稳定和平衡，当机体受到低氧刺激的时候，体内大量基因参与缺氧过程在转录水平的协调性调节。
缺氧诱导因子(HIF-1)是在缺氧条件下表达的一种转录调节因子。
它是感受氧浓度相关的转录因子。
随着研究的进展，对其结构、功能及上下游信号通路的有了进一步认识，目前有观点认为它是炎症反应的“开关”。
本文就缺氧诱导因子与其在炎症反应的作用，简要综述。
1.HIF-1的概述缺氧诱导因子的发现及结构，在20世纪90年代，由Semenza和Wang等人[1]从促红细胞生成素基因表达时发现。
随后确立了HIF-1的结及其cDNA的编码序列。
HIF-1是由HIF-1а和HIF-1β两个亚基所构成的异源二聚体.HIF-1а是其活性域,由4个功能结构域组成，分别是bHLH结构域、PAS(Per-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-Sim)结构域、ODD(oxygen-dependent degradation domain)结构域、TAD(transactivation domains, N-TAD, C-TAD)结构域。
bHLH区与PAS区负责参与蛋白二聚体的形成及DNA结合。
ODD是氧依赖结构降解域，是HIF-1降解的必须物，对其活性起重要作用。
TAD为两个转录活化所需的反式激活结构域，相对独立存在HIF-1а的羧基端，分别为N-TAD和C-TAD，其在常氧条件下，抑制HIF-1 a的转录激活。
在常氧情况下，HIF-la在特殊的脯氨酸羟化酶(PHD)的羟化作用以及与肿瘤抑制蛋白(pVHL)结合，被泛素化并降解。
在缺氧的环境中，PHD的活化受到限制，由于没有被脯氨酸残基羟基化，pVHL不能识别HIF-la，使蛋白水解率降低。
HIF-la蓄积，表达增强。
激活其下游的信号通路，从而参与HIF信号通路的调节[2].目前研究表明，HIF-1a能够控制下游100多种基因的表达，这些基因表达后参与血管形成和红细胞生成，与能量代谢和细胞存活、凋亡等活动，以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境的稳定[3]。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
[文章编号] 1000-4718(2004)08-1385-05转染缺氧诱导因子-1 对肺癌细胞A549生长的影响张惠兰, 张珍祥, 徐永健(华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸病研究室,湖北武汉430030)[摘 要] 目的:研究缺氧诱导因子-1 (HIF-1 )对人肺癌细胞株A549体内、外生长的影响,并探讨其可能机制。
方法:将HIF-1 转染人肺癌细胞A549中,观察A549细胞生长。
建立人肺癌裸鼠模型,随机将其分为两组:对照组(A组,10只),HIF-1 转染细胞组(B组,10只)。
1月后,切除瘤灶、称瘤重、计算促瘤率。
标本用免疫组化测定增殖细胞核抗原(PCNA),同时用Western blot检测HIF-1 、凋亡抑制蛋白survivin和bcl-2的表达。
结果:HIF -1 转染A549细胞后,细胞生长速率加快。
转染HIF-1 的裸鼠肿瘤生长较对照组快,A组、B组的瘤重分别为(2 51 0 33)g,(3 44 0 40)g,促瘤率为37%。
免疫组化和Wes tern blot提示:B组的PCNA表达比A组高,B组HIF-1 、survivin、bcl-2的蛋白水平明显高于A组。
结论:转染HIF-1 体内、外均可促进肺癌A549细胞的生长,其机制可能与其能促进细胞恶性增殖和抑制凋亡有关。
[关键词] 缺氧诱导因子-1;增殖细胞核抗原;肺肿瘤;A549细胞[中图分类号] R363 [文献标识码] A肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。
一般认为肿瘤是一种细胞无限增殖的疾病,它的发生是在遗传易感性的基础上,各种环境致癌因子作用使正常细胞出现增殖与凋亡平衡紊乱的结果。
因此,增殖与凋亡的平衡紊乱如何在肿瘤体内出现并得以持续成为肿瘤研究的中心问题。
Harris[1]报道,当肿瘤生长到一定程度时会出现需氧与供氧之间的不平衡,此后肿瘤会一直生长在缺氧的微环境中。
缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor,HI F-1)是1992年被Semenza等[2]发现的一个可传递缺氧信号的核转录调控因子,由 、 两个亚单位形成,其中HIF-1 受缺氧的调节,它通过与靶基因特定序列DNA结合而调控转录。
目前,有关HIF-1 在肺腺癌细胞株A549中的报道不多,本研究拟观察HIF-1 对A549体内、外生长的影响及其可能机制。
材 料 和 方 法1 细胞株与试剂真核表达质粒pc DNA3、大肠杆菌DH5 和肺癌细胞株A549购自武汉大学典型生物保藏中心,RP MI -1640培养液购自北京中山生物技术公司,限制性内切酶Ba mH I和Xbal购自华美公司,新生牛血清、T4连接酶、脂质体、G418及引物合成购自Gibcol公司,逆转录酶MMLV、随机引物及Taq聚合酶购自Promega公司。
HIF-1 兔抗多克隆抗体购自San Cruze公司,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)兔抗多克隆抗体购自北京中山生物技术公司,凋亡抑制蛋白survivin兔抗人多克隆抗体和bcl-2兔抗人多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司,过氧化物酶标记的链酶亲和素(S-P)检测试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色液购自北京中山生物技术公司。
2 细胞培养肺癌细胞A549培养在含10%小牛血清的RP MI -1640培养液中,在5%CO2培养箱中37培养。
3 HIF-1 质粒的构建3 1 引物的设计与合成 使用计算机Primer设计软件,根据人HIF-1 的序列[3]设计引物,两端分别引入Ba mH I和Xbal酶切位点。
5!-GCGGA TCC AACG TC GAAAAGAAAAGTC TCG-3! (sense);5!-GC TC T AG AAAG TTTG TGC AG T A TTGT AGC C-3!(antisense);扩增片段大小为2 55kb。
3 2 目的基因片段的扩增 应用Trizol试剂提取A549细胞内的总mRNA,mRNA样品经逆转录反应合成HIF-1 cDNA第1链,然后进行PC R扩增。
反应条件:50L反应体系中各引物终浓度为0 1mol/L, dNTP各50mol/L,MgCl21 5mmol/L,Taq酶2L。
94变性45s,56退火45s,72延伸1min,30个循环,最后72延伸10min。
3 3 连接 RT-PCR扩增产物片段和质粒pcDNA3经BamH I和Xba l酶切后,凝胶回收试剂盒回收酶切片段,在T4连接酶的作用下,4过夜;连接产物转化感受态细菌,置含Amp+的LB琼脂平板,37倒置过夜培养;挑选单菌落,直接菌落PCR方法扩∀1385∀中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2004,20(8):1385-1389[收稿日期]2002-12-03 [修回日期]2003-03-27增,挑选阳性克隆,小量制备质粒,酶切鉴定。
4 质粒的转染及筛选大量制备含pc DNA3/HIF -1 表达质粒,PE G8000纯化,取10 L(10 mol/L)质粒+100 L 无血清培养基(A 管);取10 L 脂质体+100 L 无血清培养基(B 管);混合A 与B,室温下静置30min;另取已融合70%的生长良好的A549细胞,用无血清培养基洗涤两次,加入上述混合液,再补充无血清培养基,置细胞培养箱中12h;取出,加入完全培养基。
用G418从200mg/L 开始筛选,直至转染细胞能耐受1g/L 的G418为止。
5 体外生长实验将上述培养细胞以5#108cells/L 转入六孔板培养,每日各取4孔,每孔4次记数,取其平均值,描绘生长曲线。
6 实验动物与分组20只BalB/C-nu 品系裸鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,均为雌性,鼠龄为3-4周,体重约18g,随机分为4组:对照组(A 组,10只)、HIF-1 转染细胞组(B 组,10只)。
实验和饲养均在SPF 条件下的超净工作台中进行。
7 人肺癌裸鼠模型的复制培养A549肺癌细胞至指数生长期,将单细胞悬液调整为细胞浓度1#1010cells/L,每只裸鼠接种0 1mL 单细胞悬液于一侧背部皮下,以皮下结节直径达0 5c m 为成瘤标准,1周左右成瘤,1月后处死裸鼠。
并将肿瘤标本分装,分别置入液氮冻存或甲醛固定石蜡包埋。
以备Western blot 和免疫组化之用。
8 石蜡切片免疫组化染色取石蜡块,每例均制成厚约4 m 连续切片2张,1张HE 染色,1张行PCNA 免疫组化染色。
切片常规脱蜡水化,微波抗原修复,0 3%H 2O 2去除内源性过氧化物酶,10%正常兔血清封闭,依次加入抗体,用DAB 显色,细胞核内光镜下见棕黄色产物为阳性反应。
阴性对照组省去一抗。
结果判断:在显微镜(#400)下随机选10个视野,逐个视野观察,计数每个视野下细胞核为阳性的细胞数目,计算每视野平均数。
9 Western blot三去污剂法(按∃分子克隆%配制),提取肿瘤组织总蛋白,取20 g 总蛋白,6%SDS-PAGE 凝胶电泳,100V,电泳至溴酚蓝达分离胶,加大电压至200V,直至溴酚蓝达凝胶的底部,半干电转移至硝酸纤维膜上,5%脱脂奶粉封闭,加入1&1000稀释兔抗HIF-1 多克隆抗体或survivin 兔抗多克隆抗体或bcl-2兔抗多克隆抗体,4 孵育过夜,加入1&5000过氧化物酶标记羊抗兔二抗,37 孵育2h,洗涤,ECL 方法显像。
10 统计学处理各指标数据以 x s 表示,各组间比较用t 检验。
结 果1 HIF-1 质粒酶切鉴定取小量质粒,经BamH I 和Xba l 酶切后,琼脂糖凝胶电泳,显示两条条带,分别为5 4kb 和2 55kb,与pc DNA3和扩增HI F-1 的大小一致,图1。
Fig 1 Evaluation by restriction enzymes.1:molecular wei ght marks;2:products of HIF-1 plas mid by restriction enzymes.图1 酶切鉴定2 HIF-1 的体外生长实验用HIF-1 转染A549细胞后,细胞增殖速度明显快于未转染组,图2。
Fig 2 Influence of HIF-1 on lung cancer cells A549growth. xs.n =16.P <0 05vs control group.图2 转染HIF-1 对A549细胞增殖的影响∀1386∀3 HIF-1 体外促肿瘤的生长注射正常A549细胞后,90%的动物于第7d 左右有肉眼可见的皮下小结节,约15d 左右长成2-3c m 3大小的肿瘤。
而注射转染HI F-1 的A549细胞,肿瘤成瘤速度明显快于未转染组,至5周时,两组的瘤重分别为:对照组(2 51 0 33)g,HIF-1 转染细胞组(3 44 0 40)g (P <0 05)。
促瘤率为37%。
4 免疫组织化学检测PCNA 阳性细胞为胞核呈棕黄色,而胞浆不着色。
两组阳性数分别为:对照组45 2,HIF-1 转染细胞组77 2(P <0 05),图3-4。
5 Western blot 检测结果HIF-1 的Western blot 定量分析发现:B 组62 0 2 8是A 组20 8 1 3的3 0倍(P <0 05)(图5)。
Bcl-2的结果显示:B 组45 2 1 7是A 组20 4 1 6的2 2倍(图6)。
Survivin 的结果显示:B 组40 11 9是A 组21 52 0的1 9倍(图7)。
Fig 5 Expressions of HIF-1 protein in all groups.1:HIF-1 transfected group;2:control group.图5 各组裸鼠肺组织中HIF-1的蛋白表达水平Fig 6 Expressions of bcl-2protein in all groups.1:control group;2:HIF-1 transfected group.图6 各组裸鼠肺组织中bcl-2的水平Fig 7 Expressions of survivin protei n in all groups.1:control group;2:HIF-1 transfected group.图7 各组裸鼠肺组织中survivin 的水平讨 论恶性肿瘤的发生、发展过程就是肿瘤细胞不断∀1387∀增殖的过程。
肿瘤在增殖过程中,肿瘤组织增生过快必然造成局部组织严重缺氧和供能之间的不平衡。