猪五种繁殖障碍性疫病病原体多重PCR的建立及初步应用
猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立
病毒 ， 因此 ， 过 特 异 性 引 物建 立 多重 ＲＴ Ｐ Ｒ 方 ｒｓ ＴＧ Ｖ） 猪 细 小 病 毒 （ ｏｃ ｅ ｐｒｏ ｉ ｓ 通 －Ｃ ｕ， Ｅ ， ｐ ｒｉ ａｖ ｖｒ ， ｎ ｕ 法 ， 疑似病 猪 的组织样 品进行检测 ， 对 仅需 １次反应 Ｐ Ｖ）伪狂犬病毒 （ ｓｕ ｏａ ｉ ｉ ｓＰ Ｖ） Ｐ ， ｐｅ ｄｒｂ ｓｖ ｕ ， ｒ 和猪 ｅ ｒ 即可诊 断 Ｃ Ｆ Ｐ Ｒ Ｖ 和 Ｊ Ｖ 的 单 独 或 混 合 感 圆环病毒 ２型 （ ｏｃｎ ｉ ｏ ｉｕ ｙ ｅ２ Ｐ Ｖ－） Ｓ Ｖ、 Ｒ Ｓ Ｅ ｐ ｒｉｅｃ ｃ ｖｒ ｓｔｐ ， Ｃ ２ 均 ｒ
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第２卷 第 １ ７ 期
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究近年来，随着生物技术的发展，PCR技术已经成为了现代生物学研究中一个不可或缺的工具。
在猪病诊断和防治中，PCR技术也得到了广泛的应用。
本文将从PCR技术的原理、优势以及在猪病诊断和防治中的应用等方面进行介绍。
一、PCR技术原理1.高效性：PCR技术只需微量的DNA样品就能扩增出足够的DNA数量进行PCR分析，大大节约实验时间和实验成本。
2.特异性：PCR技术基于引物和反应条件的匹配，可以精确扩增所需的DNA序列，并减少其他DNA的扩增。
3.检测灵敏度高：PCR技术可以扩增微量的DNA模板，还可以进行嵌套PCR、荧光PCR 等改良后的PCR技术，灵敏度可以达到10^-18。
4.全基因组与全转录组扩增：PCR技术可以在短时间内，扩增目标DNA的特定区域，开展全基因组或全转录组扩增，扩增速度快、操作方便，且可同时检测多个基因。
1. 常见猪病的PCR诊断：PCR技术可以检测出许多猪病的病原体，如ASFV（非洲猪瘟病毒）、PRV（猪瘟病毒）、PCV2（猪圆环病毒2）、PEV（猪拟肠杆菌），大幅提高疾病诊断的准确性。
2. 病原体检测：PCR技术可以检测毒病原体的存在，其检测灵敏度较高，能捕捉到低浓度的病原体。
3. 疫苗制备：PCR技术可以在短时间内为疫苗制备提供需要的病毒基因组，有效的提高了疫苗的制备水平。
4. 病原体载量监测：猪病防治中，及时监测病原体的载量和变化，有助于领导部门及时制定科学的防控策略和治疗方案，从而提高疫情防控效果。
5. 常见猪病的预防与控制：利用PCR技术对猪病病原体的检测，可为预防和控制常见猪病打下稳固的基础。
四、结论PCR技术的出现，极大地提高了猪病诊断和防治的水平。
猪病的早期诊断和病原体的迅速鉴定，极具重要性。
因此，相信在未来的进一步研究中，PCR技术必将得到广泛的应用，并成为猪病防治领域中的重要工具。
猪群中7种高发传染病多重PCR诊断方法的建立
Ａｎｍａ ｓ ａ ｄｙ ａ ｄ Ｆ ｅ ｃｅ ｃ ｉ ｌＨｕ ｂ ｎ ｒ ｎ ｅ ｄ Ｓ ｉｎ ｅ
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猪群中 ７ 种高发传染病多重 Ｐ Ｒ诊断方法的建立 Ｃ
贺显 晶 ， 东波 ， 孙 周玉龙 ， 云成 ， 林 韩 旭 ， 王越 强 ， 婷婷 ， 郭 武 瑞
见 猪 病 病 原 的基 因 组 无 特 异 性 扩 增 ， 测 病 原 基 因组 最 低 浓 度 可 达 到 ｐ 检 ｇ级 。 结 论 １ 研 究 建 立 的 ２套 多 重 Ｐ Ｒ诊 断 方 『 该 Ｃ 法可以 用于猪群 中上 述 ７种猪病 痛原 的 单一 感染或 混合 感染 的鉴 别诊 断。
ｅａ ａｅ，ｅｐｃｉ ｌ． ［ｅｕ ］ ｈ ｅｏ ｉ Ｄ Ａｏ ｈ ｒ ｏ ｏ ａ ｏｅ ｓ ｅｅ ｏ ａ ｐｉｅ ｙ ｈ ｏ ｌｐｅ Ｃ ｅ ｏｓ ｖｌ ｔｄ ｒｓｅｔ ｅ ｕ ｖ ｙ Ｒ ｓｈ Ｔ ｅ ｎ ｍｃ Ｎ ｆ ｔｅ ｍｍ ｎｐｔ ｇｎ ｒ ｎ ｔ ｍ ｌ ｄｂ ｅｔ ｔ ｌ Ｐ Ｒ ｍ ｔ ｄ， ｇ ｏ ｃ ｈ ｗ ｉ ｆ ｔ ｗ ｍｕ ｉ ｘ ｈ ａｄｔｅｄ ｔ ｔ ｎｌ ｔ ｆ ｈ ｏｍ ｌｐｅ Ｃ ｔｏｓｗ ｓ ｔ ｉ ｇａ ｖｌ ｆ ｅｏ ｃＤ Ａ ｏ Ｄ Ａ 【ｏ ｃ ｓ ｎ Ｔ ｅｔｏ ｎ ｅ ｃ ｏ ｍｉｏ ｔｅｔ ｕｔ ｌ Ｐ Ｒｍｅ ｄ ａ ｐｃ ｒｍ ｌ ｅ ｏ ｎｍｉ Ｎ ｒ Ｎ ． Ｃ ｎ ｌ ｉ 】 ｈ ｈ ｅｉ ｉ ｗ ｉ ｘ ｈ ａａ ｏ ｅ ｇ ｃ ｕｏ ｗ
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多重PCR方法快速检测猪的5种呼吸道病原菌
U sing this multiple PCR method，bacteria could be detected from lung tissues of challenged mice w ith App，H ps，Bb and T+ Pm respectivel h in Tryptic Soy Broth (T SB) supplem ented with 5%calf serum and NA D + factor．Sim ultaneous detection of pathogens in 269 clinical sam ples from the central area of China revealed the universal existence of App， H ps，Bb，T + Pm and M hp．In conclusion，the multiple PCR assay show ed excellent specificity， sensitivity and reduplication and could detect five pathogenic bacteria of respiratory tract in sw ine．We expected that this multiple PCR assay could be useful extensively for epidemiological survey and clinical differential diagnosis of five com m on respiratory diseases in swine． K ey words：swine；respiratory tract disease；m ultiplex PCR ；detection
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究猪是我国畜牧业中重要的经济动物之一，猪病种类繁多，给生产带来了很大的压力。
传统的猪病诊断和防治方法往往需要耗费大量时间和人力物力，而且准确率也有一定的局限性。
因此，为了提高诊断的准确率和效率，现代分子生物学技术应用于猪病诊断和防治中已成为时代的发展趋势之一。
其中，聚合酶链反应（PCR）技术因其高灵敏度、高特异性和高效性，已成为一种广泛应用于猪病诊断和防治的技术手段。
猪病中常见的病原体包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。
其中，病毒感染是影响猪的健康和生产的主要因素。
而PCR技术的应用在病毒和细菌的检测中具有很高的优势。
在猪病诊断中，PCR技术具有以下优势：1.高灵敏度：PCR技术的灵敏度比传统的检测方法高出10倍以上，可以检测到病原体中极少量的核酸。
采用PCR技术可以在疾病的早期快速检测到病因，提高了诊断的准确性和正确性。
2.高特异性：PCR技术可以特异性地检测出目标病原体的DNA或RNA，同时对其他的无关物质不产生干扰，从而消除了假阳性的可能性。
3.高效性：PCR技术可以同时检测多种病原体，有效地提高了检测的效率和准确性，缩短了检测时间。
在猪病防治中，PCR技术的应用主要体现在以下两个方面：1.基因工程疫苗的研发：PCR技术可以快速地克隆、分离与定量病原体的基因，便于对病原体进行进一步的研究和分析，为基因工程疫苗的研发提供了基础。
2.免疫学研究：PCR技术可以准确、快速地检测病原体的存在和数量，为免疫学研究提供了有效的手段和参考基础。
近年来，随着PCR技术的不断发展和完善，荧光定量PCR（qPCR）技术已成为PCR技术的一个重要分支。
相比传统PCR技术，qPCR技术更加准确、可靠和高效。
其操作简便，只需少量病原体DNA或RNA即可检测，能够准确地测定样品中病原体的数量，并且不受污染的干扰。
因此，荧光定量PCR技术在猪病诊断和防治中应用将会更加广泛。
总之，PCR技术已经成为现代分子生物学技术中一种重要的检测手段，在猪病诊断和防治中具有重要的应用前景。
浅谈猪病检测中多重PCR技术的运用
２ 猪病 检 测 中多重 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 的应 用
２ ． １ 常规 猪病 的诊 断
果显 示 ，该方 法 具 有特 异 性 良好并 且 灵 敏度 非 常高 等特 点 ，可 以 实现 对 混 合感 染 病 毒 的 同一 时 间 的检 测 。其 二 ，和 Ｌ Ａ Ｍ Ｐ 技术 的 多重 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 在 常 规 猪 病 诊 断 中 的 应 用 主 要 包 括 有 两 个 方 有 效 结合 ，Ｐ ａ ｒ ｋ 等 学 者对 可 以使 猪 换 上增 生 性肠 病 的 劳森 氏 菌 中
借 助全 基 因组 测 序 展开 了特 异 性 引物 的设 计 ，从 而 实现 了对 多重
究 ，Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 已经 成 功衍 生 出 了多种 新 技 术 ，特 别 是 多重 Ｐ Ｃ Ｒ 技 物 特 异性 非 常 良好 ，灵敏性 非 常高 等 特 点 ，同 时各个 引 物 之间 并
多重Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 在 范 围 内属 于Ｐ Ｃ Ｒ 众 多技 术 中的其 中一 个 ，最 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 的 建立 ，采用 该 方法 对 链球 菌 展 开鉴 别诊 断 ，最终 结 果 Ｃ Ｒ 四次 之后 ，成 功 的将３ ３ 种 血 清型 鉴别 出来 】 。 早 是在 １ ９ ８ ８ 年 提 出 的 ，多重 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术具 备 有 实 验进 程 比较 快 ，试 是 ，通 过多 重Ｐ 验 成本 非 常 高 ，高 效快 捷 ，敏 感 性强 ，特异 性 强等 多 种优 点 ，如 ２ ． ３ 和其 他技 术 的结合 以及 创新 应用 今 已经 在 微 生 物 ，动 物 以及 人 类 研 究 中都 得 到 了非 常 广 泛 的应 其一 ，和荧 光定 量Ｐ Ｃ Ｒ 技术 相结 合 。王 乃富 等学 者价 将猪 水 用 。该 技 术 的原 理 和Ｐ Ｃ Ｒ 技术 的原 理几 乎 一样 ， 即可 以在 同 一个 泡 病病 毒 ，水 泡 性 口炎 ， 口蹄 疫病 毒 的蛋 白编码 基 因作 为 依据 进
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用1. 大宗猪病的PCR诊断大宗猪病包括猪传染性胸膜肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、猪病毒性腹泻等。
传统的病毒分离与鉴定技术需要大量时间和人力成本，而PCR技术具有快速、灵敏和特异的特点，能够对病毒进行高效、快速的检测和鉴定。
PCR技术在大宗猪病的诊断中有着广泛的应用前景。
除了大宗猪病外，个体猪病的诊断也是养殖业中的重要问题。
猪瘤胃溃疡、猪传染性胃肠炎等病害，常常需要针对个体猪进行病原检测。
PCR技术能够通过分子生物学方法快速、准确地检测出病原体，为个体猪病的诊断提供了有力的技术支持。
二、PCR技术在猪病防治中的应用疫苗是猪病防治的重要手段，而PCR技术在疫苗研发中发挥着重要作用。
通过PCR技术可以对病原体进行快速、准确的检测和鉴定，为疫苗株的选择和研发提供了重要的技术支持。
PCR技术还可以用于评估疫苗的效果，检测疫苗的抗原性和免疫原性，为猪病疫苗的研发提供了重要的技术手段。
除了疫苗研发外，PCR技术还可以在猪病的预防中发挥重要作用。
通过对猪场环境、饲料、水源等进行PCR检测，可以及时检测出潜在的病原体，做到早期预警和隔离，有效防止猪病的传播。
PCR技术还可以监测猪群的免疫水平，指导疫苗接种计划，提高猪群的免疫力，降低猪病的发生率。
1. 优势(1) 高度敏感性和特异性：PCR技术能够对极少量的目标DNA进行检测和扩增，具有较高的敏感性和特异性。
(2) 快速性：PCR技术可以在几小时内完成病原体的检测和鉴定，相比传统的病原分离与鉴定技术更快捷高效。
(3) 高通量：PCR技术可以对多个样品同时进行检测，提高检测效率和成本效益。
2. 局限性(1) 样品处理复杂：PCR技术对样品的处理和提取要求较高，容易受到外部因素的干扰。
(2) 容易产生假阳性：PCR技术在样品提取、试剂配制和扩增过程中易受到污染，容易产生假阳性结果。
(3) 高成本：PCR技术在设备、试剂和人力成本上相对较高，需要较为专业的技术人员进行操作。
一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法[发明专利]
![一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/359f42427ed5360cba1aa8114431b90d6c858923.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810645013.2(22)申请日 2018.06.21(71)申请人 河南牧业经济学院地址 450046 河南省郑州市郑东新区龙子湖北路6号(72)发明人 李文刚 刘胜利 吕玉金 刘玲玲 吴凤笋 马文涛 (74)专利代理机构 北京轻创知识产权代理有限公司 11212代理人 谈杰(51)Int.Cl.C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/70(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法(57)摘要本发明公开了一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法，该方法的建立一方面可应用于临床样品的检测，另一方面为多重PCR诊断方法的建立奠定了基础。
其技术方案如下：设计CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2特异性引物，提取病毒DNA和RNA，并将RNA进行反转录。
随后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确立最佳多重PCR反应体系及反应程序。
按照最佳多重PCR反应条件进行试验，对该方法的特异性、敏感性及稳定性进行验证，同时进行临床样品检测以验证此方法操作的可行性。
本发明不仅保留了常规PCR的高度特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。
权利要求书2页 说明书6页 附图3页CN 108753936 A 2018.11.06C N 108753936A1.一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)PPV和PCV2病毒DNA的提取；2)CSFV、PRRSV和JEV病毒RNA的提取以及反转录；3)特异性引物设计与筛选；4)对步骤3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化，从而建立最佳多重PCR反应体系；5)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；6)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；7)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR稳定性验证；8)按照建立的多重PCR方法对临床样品的检测，以验证该方法的可行性。
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动物医学进展，2〇17,38(3):27-31Progress in Veterinary Medicine猪五种繁殖障碍性疫病病原体多重P C R的建立及初步应用王苗苗，张凡庆，王曼，朱建国*(上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室，上海200240)摘要：为了建立能够同时检测猪瘟病毒（CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪伪狂犬病病 毒（PRV)、猪圆环病毒2型（PCV2)和猪细小病毒（PPV)的多重PCR，并用于猪场感染情况的动态监控以及 临床诊断，根据GenBank中已发表的5种病毒的基因序列，针对CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、P R V的gB、PCV2的0RF2和P P V的VP2基因，分别设计了特异性引物。
在建立的单项PCR基础上，通过优化反应条 件，建立了能同时检测5种病毒的多重PCR，并具有较高的灵敏性和良好的特异性。
采用建立的多重PCR 对127份疑似病猪的扁桃体活体组织进行检测，检出了 5种病毒的存在，其中感染2种及以上病毒的样品比 例为38. 6%(49/127)，表明该方法是一种快速、灵敏、高效的病原学检测手段。
关键词：猪瘟病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪伪狂犬病病毒；猪圆环病毒2型；猪细小病毒；多重聚合 酶链反应中图分类号：SS854. 44;S858. 28在猪场常发生的各类疫病中，猪繁殖障碍性疾 病给猪场的整体经济效益造成了严重影响[>3]，这类 疫病主要表现为感染母猪发生流产、死胎、木乃伊胎 等，公猪发生一定的繁殖障碍，感染仔猪出现大量死 亡，或发生混合感染和继发感染[4]。
如何有效预防 和控制此类传染性疾病的发生，保证猪群的良性发 展，是一项亟待解决的艰巨任务，因此，做好猪群的 疫病监控工作就显得尤为重要。
猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征 病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV)、猪圆环病毒 2 型 （Porcine circovir-us type 2，PCV2 )和猪细小病毒（Porcine parvovir-us，PPV)是引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原[5_6]。
由于这几种疫病在临床上呈现相似的症状，又常常 发生混合感染，根据临床症状较难进行鉴别诊断[5’7]。
常规的诊断方法如病毒分离、血清学诊断方 法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷，已不能满足现 实临床诊断需要。
近年来，随着分子生物学技术的 快速发展，各种分子生物学检测手段接连出现，大大 提高了疫病的检测水平，其中多重PCR具有敏感性 高且可以一次检测多种病原的优势，更加适于混合 感染的快速诊断[8]。
因此，建立能够同时检测CS-文章编号：1〇〇7-5038(2017)03-0027-05FV、PRRSV、PRV、PCV2 和 PPV 的多重 PCR诊断 方法，并用于猪群的实时监控，及时准确地对疫病进 行定性检测，对于这些疫病的防控具有重要意义，也 可为流行病学调查提供技术手段[9]。
1材料与方法1. 1材料1.1.1样品来源 样品采集于2014年一2015年间上海、江苏、安徽地区部分猪场，采集临床表现疑 似患病猪的扁桃体活体组织，共127份。
1.1.2病毒株、阳性对照猪繁殖与呼吸综合征病 毒（PRRSV)，上海交通大学抗体工程实验室保存；猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒（CSFV)、猪细小 病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)，上海市动物疾 病预防控制中心提供。
1.1.3 主要试剂 T Trizol Reagent,Invitrogen公司 产品；dNTP、T a<?DNA聚合酶、质粒抽提试剂盒、反 转录试剂盒、DNA Marker DL 2 000、Agarose，TaKaRa公司产品；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，Axygen公司产品；病毒DNA抽提试剂盒，宝生物 工程（大连）有限公司产品；DH5a感受态细胞，上海 交通大学抗体工程实验室保存。
1.2方法1.2.1引物设计与合成根据GenBank已发表的文献标识码：八收稿日期=2016-07-27基金项目：上海市生猪产业技术体系建设项目[沪农科产字（2016)第6号]作者简介：王苗苗（1991一），女，河南沈丘人，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究。
*通讯作者28动物医学进展2017年第38卷第3期（总第285期）序列，应用P n m er5. 0软件对各自保守区设计5对网站对其特异性进行鉴定，结果显示，所设计引物均引物（表1)，分别选择C S F V的E2基因、P R R S V的具有良好的特异性。
引物由上海生工生物工程技术N S P2基因、P R V的g B基因、P C V2的O R F2基因、服务有限公司合成。
P P V的V P2基因为其扩增靶序列.，同时通过NCBI表l多重PC R引物T a b le 1 P rim e rs for m u ltip le x P C R病毒基因引物序列长度/bp扩增长度/bp V iru s G ene P rim e r seq u en ces L e n g th P ro d u c t sizeC S F V E2P I ： A G C C T G T G G A A T C C A C T A T C20627 P2 ：A A T A C A G C C A T G G T T T G C A G20P R R S V N SP2P I ： T G G T C C T A A C G G T T C G G A A G A A A C24404 P2 ： G T G A G C T G A G T A T T T T G G G C G T G T24P C V2O R F2P I ：C T G T T T T C G A A C G C A G T G C C20506 P2 ： C G C T G G A G A A G G A A A A A T G G20P R V gB P I： A T C A C G A A C C G C T T C A C G18843 P2 ： C A G C T C G T T C G A G A T C A G19P P V V P2P I ：G G T A C A A G A C G A T G C A C A C A20254 P2 ：T A T T G G T G T C T A G T G C G A C C201.2.2病毒核酸的提取取疑似病猪扁桃体活体 组织于DEPC水处理过的2 m L离心管中，并加人1 mL PBS(pH7.2)，经全自动组织研磨机混合研磨匀 浆后，反复冻融3次，8 000 r/min离心5min,上清 转移至DEPC水处理过的1. 5m L离心管中，按照 DNA/RNA提取试剂盒说明书操作步骤分别进行。
1.2.3 R N A病毒模板制备取抽提好的病毒 RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂说明书进行反 转录。
反应体系为10pL，其中RNA8pL、TaKaRa 反转录试剂盒中 5X Primer Script RT Master Mix 2juL。
经 37*C1 5min，85*C5s，4*C1min 后置于 一2(TC保存备用。
1.2.4 单项P C R检测方法的建立分析测定 PC R最佳反应条件，包括退火温度、引物浓度、MgCl2浓度等。
分别确定每种病毒的单项PC R最 佳反应条件。
单项PCR反应体系总体积为25 pL : 150 mmol/L MgCl2 2 juL,2. 5mmol/L dNTP 1juL, lOXTag buffer2.5juL,上、下游引物各 0• 5juL(每条 引物浓度 25 nmol/L)，模板 1pL，0. 5U"L Tag酶 2 yL，加灭菌双蒸水补足25 pL。
单项PCR扩增条 件：CSFV、PRRSV 扩增：95*C5min;94*C30 s，55*C 50 s，72'C 30 s，循环 30 次；72'C延伸 10 min。
PRV、PCV2、PPV扩增：95*C 5min;94*C 30 s，56*C 50 s，72*C 45 s,循环 30 次；72*C延伸 10 min。
1.2.5构建模板质粒将得到的阳性样品PCR 产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后，分别克隆至 PMD-18T Vector载体，重组质粒转化后用质粒抽 提试剂盒进行提取。
提取的质粒经测序验证后用超 微量紫外分光光度计测定浓度。
1.2.6多重PCR检测方法的建立在建立的5种 病毒单项PCR基础上，对多重PCR反应体系中各 项条件进行优化，确定多重PCR最佳反应条件：总体积 25 juL，包括 150 mmol/L MgCl22 juL，2. 5 mmol/L dNTP 2 juL,10 X Taq buffer 2. 5juL,5病毒上下游引物各〇. 5y L(每条引物浓度25 nmol/L)，DNA/cDNA 模板 2 juL，0_ 5U/pL Tag 酶2 ^L，加灭菌双蒸水补足25 ^L。
多重PCR扩增 条件：95*C 5min;94*C 30 s，56*C 50 s，72*C 45 s，循环35次；72S C延伸10 min。
1.2. 7敏感性试验采用超微量紫外可见分光光 度计对5种病毒的质粒浓度进行测定^尺¥、〇3_ FV、PCV2、PRRSV、PPV 初始浓度分别为 92、39、12、10、21 ng/^L，然后分别进行10倍系列稀释，10°〜1(T5倍。
等比混合后按上述优化后的多重PCR反应条件进行检测，确定其敏感性。
1.2.8特异性试验在加人5种被检病毒引物的 前提下，分别对 CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV 及该5种病毒混合物、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TTGEV)、猪 流行,注腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪链球菌（S.Mre外o c o c c m s)、副猪嗜血杆菌 (H.param i5)、大肠埃希菌（i/i)和金黄色葡萄 球菌（S.及阴性对照进行多重PCR，以检测其特异性。
1.2.9 重复性试验采用已优化的多重PCR对 PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5 种病毒的阳性样品各2份重复试验3次，以确定该多重PC R的稳 定性。