PCR引物设计
PCR引物设计
PCR引物设计PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。
引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
PCR引物设计
PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR引物的设计对PCR反应的成功与否至关重要。
下面将详细介绍PCR引物的设计过程。
第一步，选择目标序列。
在设计PCR引物之前，首先需要确定要扩增的目标序列。
目标序列可以来自已知基因的特定片段，也可以通过测序等方法获得。
第二步，引物长度和温度。
PCR引物通常为单链DNA片段，一般长度在18-30个碱基对之间。
引物长度过短容易引起非特异性扩增，引物长度过长则会导致特异性降低。
此外，引物的长度还会影响PCR反应的温度。
一般情况下，引物的长度越长，PCR反应的温度就需要越高。
通常，引物的长度最好在20-24个碱基对之间。
第三步，引物序列的选择。
为了确保PCR反应的特异性，引物的选择至关重要。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基序列，以确保引物能够精确结合到目标序列上。
此外，引物的序列还应避免序列内部的反向重复和结合位点之间的重复序列。
第四步，引物的熔解温度（Tm）的确定。
引物的熔解温度是引物与模板DNA结合的温度。
引物的熔解温度应该尽量接近反应的最低温度，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
引物的Tm可以通过以下公式计算：Tm = 69.3 + 0.41 * (G+C%) - 650/length其中G+C%表示引物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分含量，length表示引物的长度。
第五步，特异性分析。
在设计引物之前，可以通过生物信息学工具对引物进行特异性分析。
特异性分析可以通过引物序列与目标序列的比对来进行。
引物在目标序列上应有唯一的结合位点，并且不应该与其他非目标序列有任何重复的位点。
第六步，引物的杂交性能。
为了确保引物的杂交性能，引物应具有适当的糖尖端修饰和杂交性能。
糖尖端修饰可以增强引物的杂交性能，并减少非特异性结合。
此外，引物的GC含量应该适中，过高或过低都可能导致非特异性结合的问题。
第七步，引物的交叉反应。
引物设计的详细步骤
引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。
引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。
选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。
GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。
避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。
可以使用软件工具检查引物的这种可能性。
避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。
选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。
此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。
使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。
这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。
实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。
引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。
请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。
引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。
因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。
步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。
这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。
确定目标序列后，我们可以继续设计引物。
步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。
这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。
引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。
过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。
GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。
在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。
Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。
Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。
引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。
步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。
此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。
步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。
这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。
特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
(完整版)PCR技术(包含引物设计)
聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
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PCR引物设计
记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR 条件摸索的讨论。
后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。
PCR的第一步就是引物设计了。
引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。
总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。
有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。
为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。
一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。
这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：/BLAST/。
选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。
BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。
将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。
如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。
最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。
可是使用BLAST还是有其不方便的地方。
因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。
如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。
在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。
⑥引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。
3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
⑦引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重
叠以防引物二聚体的形成。
一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。
很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。
以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。
a 添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。
一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。
但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，Hind Ⅲ 3个。
其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》。
里面一些规则是所有表达都通用的。
有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。
不过这种方法虽然方便但并不推荐。
有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。
一旦出现问题，分析起来更麻烦。
b LIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。
用LIC 法制备的pET 载体有不互补的
12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。
扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。
T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。
由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。
c 定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。
但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。
因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有
方向”了。
d In-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。
此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。
只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。
这种方法特别适合大批量的转化。
这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email推荐给生物通。
说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。
如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。
因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。
在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。
（生物通谢菲）。