第17章 重组

过重组可加快物种变异的过程。此外，DNA重组还参与许
多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复中发挥重 要作用。
DNA重组包括:
同源重组（homologous recombination）
位点特异性重组（site-specific recombination）
1、同源重组（homologous recombination）
3.1％，分别属于5个不同的转座子家族，分别是Ty1，Ty2，
Ty3，Ty4和Ty5。这5个转座子家族在结构和转座机制上均类 似于反转录病毒。
2.2、非病毒型反转录转座子
长散布元件（long interspersed elements, LINES ） 和短散布元件（short interspersed elements, SINES）
录病毒的包膜蛋白基因，因此LTR反转录转座子不能形成有感染能力的胞外病
毒粒子，而只能形成局限于宿主细胞内病毒样颗粒。
(2)第二类反转录转座子的成员不含LTRs，也称为非病毒型反转录转座子。
2.1、LTRs反转录转座子(P538)
Ty因子
Ty是酵母转座子（transponson yeast）的缩写。酵母基 因组中随机分布着331个拷贝的Ty因子，约占酵母基因组的
同源单链，形成Holliday结构。
RecA介导的链交换可以分为三个阶段： RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段； RecA－ssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的 联会阶段，在这一阶段可能形成三螺旋（triplex）结构； 发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出 双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。
同源重组（homologous recombination ）发 生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过
程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段
发生交叉与互换。
1.1、 Holliday 模型 两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中 两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位 置上同时切开。在切口处发生链的交换，形成所谓的
1.2.3、DNA修复和同源重组（P533）
同源重组的首要功能是复制后修复
同源重组修复DNA损伤的机理
二、位点特异性重组
位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，该过
程能由两个只具有很短相同序列的DNA分子引发，由能识别特
异DNA序列的蛋白质介导，不需要RecA蛋白和单链DNA。
1、λ 噬菌体（P534）
解3’末端链。一个正在被RecBCD加工的DNA的末端会
形成一个5’端拖尾。
Chi位点
RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点
大肠杆菌基因组中的一种不对称的8 bp核苷酸序列，
5′-GCTGGTGG-3′，Chi位点能够改变RecBCD的酶活
性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分，是重组的热 点。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性 便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制， 5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末
通过DNA-RNA-DNA方式进行转座的可移动因子，即转座子转录
产生相应的RNA，再经逆转录生成新的转座子DNA并整合到基 因组中。
反转录转座子被划分为二个主要类群：含LTRs的转座
子和不含LTRs的转座子。
(1)含LTRs的转座子，又称为病毒型反转录转座子。这类转座子在结构上 与反转录病毒的基因组相似，都具有250～600bp长末端重复（long terminal repeats, LTRs）。 LTRs反转录转座子与反转录病毒的基本区别是LTR反转录转座子缺少反转
是哺乳动物基因组中最丰富的中度重复DNA。在人类基因组
中，LINES的全长为6～7 Kb，SINES的长度约为300 bp。它 们属于非病毒型反转录转座子。
2.2.1、长散布元件
哺乳动物基因组中最丰富的LINES是L1家族。L1元件缺少LTR，
其末端具有一串长度不等的AT碱基对。完整的L1元件长6.5 Kb，
一、重 组
DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合， 称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA （recombinant DNA）。由于重组，一个DNA分子的遗传信 息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以 改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存 在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义。通
形成的短正向重复序列。短散布元件的结构使它们能够以RNA
为中介在基因组中扩增。
点旋转形成的Holliday异构体。
1.2、同源重组的分子机制
1.2.1、大肠杆菌的同源重组机制 通过遗传分析，在大肠杆菌中已经发现了3种重 组途径，即RecBCD、 RecE、RecF途径（P532)。
这3种途径所共有：（1）产生一个具有3’－OH
末端的单链DNA片段；（2）单链DNA侵入其同源双链
5’、3’端为非编码区（untranslated region， UTR），中间 含两个阅读框，ORF1和ORF2。ORF1相当于gag基因，编码一种DNA 结合蛋白，ORF2编码逆转录酶。
2.2.2、短散布元件
短散布元件的结构特点是：具有一个内部RNA聚合酶III启动 子，具有一长度不同富含A/T的3’末端，以及两侧由靶DNA倍增
λ 噬菌体侵入大肠杆菌后，面临着裂解生长和溶原生长的选择。要进入 溶原状态，游离的λ 噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称 为整合（integration）。由溶原生长进入裂解生长，λ DNA又必须从宿主染 色体上切除下来，这个过程称为外切（excision）。这里，整合和外切均需 要通过细菌DNA和λ DNA特定位点之间的重组来实现。
转座子的类型：
a.复制型DNA转座子 b.保守型DNA转座子 c.逆转录元件
1、复制型和保守型DNA转座（P538)
复制型和保守型DNA转座的区别
复制型和保守型DNA转座的模型
2、逆转录元件的转座
已研究过的所有真核生物，从酵母到人类，都含有逆转 录元件转座子（retrotransposons）。反转录转座子是一类
相同的两条单链，拆分Holliday中间体。
1.2.2、真核细胞的同源重组 在真核细胞中已经发现了两种与细菌RecA蛋白同 源的蛋白质：RAD51和DMC1。这两种蛋白质在减数分 裂重组中发挥重要作用。RAD51在进行有丝分裂和减
数分裂的细胞中广泛表达，而DMC1则仅在细胞进入
减数分裂时被表达。依赖DMC1的重组倾向于发生在 非姊妹染色单体之间。 真核生物中Holliday结构的解离机制？
DNA分子；（3）形成Holliday中间体，并发生分支
迁移；（4）内切核酸酶对中间体进行切割，连接后 产生重组体；（5）三种重组途径均需要RecA蛋白。
RecBCD通路
RecBCD与dsDNA的末端结合，然后以大约每秒1000 bp 的速度解开DNA双链，同时降解解旋产生的ssDNA。 RecBCD对两条单链的降解速度是不一致的，它优先降
端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活
性未受到影响。
RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi
单链的侵入（strand invasion）
由RecA蛋白介导。RecA是一种单链DNA结合蛋白，参与大肠
杆菌中所有的同源重组事件。它催化一个双链DNA分子的3′末端
单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区，同时置换出
分支迁移和Holliday中间体的拆分
分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和 RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到 Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋
酶，但RuvB自身不能有效地与DNA结合，它需要与
RuvA一起起作用。RuvC蛋白催化断裂反应，切开极性
att位点（attachment site） 核心序列（O） 旁侧序列
2、位点特异性重组在基因工程中的应用
Cre-LoxP重组酶系统三转座在生物的基因组中存在一类特殊的DNA序列，它们能够作 为独立的单位从基因组的一个位置移动到另一个位置，这种能 够改变自身位置的DNA序列被称为转座子（transposons）。 转坐不是一种重组类型，而是利用重组过程。
Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对
应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在
Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生 单链切口，形成的游离端在同源位点侵入未打开的双螺旋并 取代其中一条链，形成一个D－环（D-loop）（P529)。
1.3、同源重组的双链断裂模型（P530)
根据该模型，重组时两个彼此配对的DNA分子的中 的一个发生双链断裂，而另一个保持完整。双链断裂
后，在核酸外切酶的作用下，切口被扩大，并且形成 2
个3’单链末端。其中一个单链末端侵入未打开的双螺 旋的同源区，并取代其中的一条链，形成D环。后形成 两个Holliday结构。
Holliday 中间体是否真的存在？ 从细菌和动物细胞中可以分离出正在发生重组 的质粒和病毒DNA。从它们的电镜照片上，我们可 以发现与Holliday中间体的交叉结构和围绕着交叉
连接分子（joint molecule），也称Holliday结构
（Holliday structure）。分支点可以发生移动，称 为分支迁移（branch migration），分支迁移的结果
是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。
重组体
重组体
1.2、Meselson-Radding 模型