《HDNA修复重组》PPT课件
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DNA重组技术PPT课件
18
史密斯在研究流感嗜血杆菌从噬菌体 P22接受DNA的机制时，于1968年发现了一 类新的限制酶，它们分别在特定部位切断 DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核 苷酸的顺序和用于DNA重组技术。
16.07.2020
19
基因载体（简称载体）
主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类。
➢ 1952年，英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家 J．莱德伯格等在首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗 传因子。
16.07.2020
基因工程
12
DNA重组技术发展简史
16.07.2020
13
重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究 • 限制性核酸内切酶（简称限制酶） • 基因载体（简称载体）。
16.07.2020
14
限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用
阿尔伯 Wemer Arber 瑞士生物学家 巴塞尔Biozentrum大学
DNA重组技术
徐纪茹
2011-03-01
16.07.2020
1
概述
1
点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余 的文字修饰，言简意赅的说明分项内容……
2
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3
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5
转化
16.07.2020
6
接合
16.07.2020
7
转 导
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8
16.07.2020
9
融源性转换
DNA重组技术ppt课件
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
DNA的修复PPT课件
③
❖ 核苷酸切除修复 DNA切割酶切割移去12-13个核苷酸 （原核）或27-29个核苷酸（真核） 的 单 链 DNA ， 再 由 DNA 聚 合 酶 和 DNA连接酶修复DNA链
二聚体
错配修复（Mismatch repair)
错配修复碱基来源：校正活性所漏校的碱基
+ ----- A----- ------C----DNA mismatch
★ DNA合成过程中的甲基化变化 DNA中的GATC (palindromic seq.) 为m6A甲基化敏感位点 平均每2kb左右有一GATC seq. 错配修复系统受甲基化的引导
• 错配修复
• 一旦在DNA复制过程中发生错配， 通过该系统几乎能完全修正。该系 统对DNA复制忠实性贡献很大。
• 修复过程：
光复活（photo reactivation ） 直接修复
----TT-------AA----
----TT-------AA----
• 复制前、不容易出错 • 400 nm 蓝光、PR 酶
(photo-reactivation enzyme) 光敏裂合酶（photolyase）
可见光激活
----TT-------AA----
修复嘧啶二体 DNA的修复，导致变异
2020/12/27
1
• 重点内容：①DNA损伤修复方式；②DNA突 变类型
• 难点内容：①基因间校正
• 教学目的：①了解DNA损伤的原因及修复方 式；②突变的产生及校正。
引起损伤的因素: ♦ 自发性损伤(复制中的损伤、碱基的自发性化学改变、
脱氨基、碱基丢失、 细胞的代谢产物对DNA的损伤) ♦ 物理因素引起的损伤(电离辐射、紫外线) ♦ 化学因素引起的损伤（烷化剂、碱基类似物） 引起损伤的类型：
DNA重组(共26张PPT)
加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
Klenow
补平
DNA接头(adapter)连接法
连C5T'杆G的CA5G’-末GG端G和GC待G克隆的DNA片段5G’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化G，A然T后C再C通过T4DNA连接酶G的G作A用T使C两者连接起来。
G C 3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
：在最佳反应条件下15 才能发挥其连接DNA分子的功能作用
3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
℃反应1 小时，完全连接 目的序列回收产 5.0μL 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
能源辅助因子 NAD+
ATP
功能
催化DNA粘性末端 粘性末端、平末
的连接
端均可连接
5.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活性 10×连接缓冲液 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
5 体外连接DNA片段的方式
1.0μL
这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，
5'
5' GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAGBa5m位' H点I酶切
GAATTGGGGGGGATCC
GGATCCCCCCC AATTC
Klenow
补平
DNA接头(adapter)连接法
连C5T'杆G的CA5G’-末GG端G和GC待G克隆的DNA片段5G’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化G，A然T后C再C通过T4DNA连接酶G的G作A用T使C两者连接起来。
G C 3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
：在最佳反应条件下15 才能发挥其连接DNA分子的功能作用
3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
℃反应1 小时，完全连接 目的序列回收产 5.0μL 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
能源辅助因子 NAD+
ATP
功能
催化DNA粘性末端 粘性末端、平末
的连接
端均可连接
5.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活性 10×连接缓冲液 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
5 体外连接DNA片段的方式
1.0μL
这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，
5'
5' GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAGBa5m位' H点I酶切
GAATTGGGGGGGATCC
GGATCCCCCCC AATTC
《DNA的复制和修复》PPT课件
原核生物DNA聚合反应有关的酶类
（1）DNA聚合酶(DNA polymetases) （2）引物酶(peimase)和引发体 (primosome) ：启动RNA引物链的
合成。
(3） DNA连接酶（DNA ligase） （4）DNA解链酶(DNA helicase)
(5）单链结合蛋白(singlestrand binding protein,SSB)： 结合在解开的DNA单链上，防止重 新形成双螺旋。
DNA的 半保 留复 制实 验依
据
1958年 Meselson & stahl用同位素示 踪标记加密度梯 度离心技术实验, 证明了DNA是采取 半保留的方式进 行复制.
[15N] DNA [14N- 15N] DNA
[14N- 15N] DNA [14N] DNA
复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 (Caims实验)
120，000 100 + + -
0 .05
400，000 10-20 + + 50
功能
切修除复引物 修复
复制
1999年发现聚合酶 和 ，它们涉及DNA的错误倾 向修复（errooune repair）
DNA聚合酶的3´- 5´外切酶水解位点
3´
5´
错配碱基
5´ 3´- 5´核酸外切 3´ 酶水解位点
第十二章 DNA的复制和修复
本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保 留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损 伤和修复、突变和重组作一般介绍。
DNA 是 绝 大 多 数 生 物 体 遗 传 信 息 的 载 体 ， 继 1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后， 1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma) 揭示了遗传信息的传递规律。
DNA复制,修复和重组
诱变剂：引起突变的任何物理因子或化 学因子称诱变剂或诱变因子。
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
一些生物学过程也引起突变，如病毒的 感染（在染色体上的整合等）。
2. 突变的分类
点突变：用一个碱基对替换另一个碱基 对的突变。
插入（insertion）和缺失（deletion）：插 入和缺失都可以造成基因的框移突变 （frame shift mutation）。
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
b.多聚酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction），在试管内扩增一个特定 基因组片断的一个方法。
4. E.coli 三种DNA聚合酶的比较
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
以上两个过程复制和校对，都依赖碱基
配对中的非共价相互作用，这是提高信 息分子复制高保真度的根本方法。
六. 大肠杆菌有多种DNA聚合酶
1. DNA polymerase I 的特性
5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性；
5’－3’外切酶活性。
l DNA合成速度不及复制叉移动速度的 1/20，16-20 nt/s；
c. DNA复制是半不连续的；
I. 冈崎片断（Okazaki fragments）；
II. 复制叉上的前导链（leading strand）和 滞后链（lagging strand）；
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
一些生物学过程也引起突变，如病毒的 感染（在染色体上的整合等）。
2. 突变的分类
点突变：用一个碱基对替换另一个碱基 对的突变。
插入（insertion）和缺失（deletion）：插 入和缺失都可以造成基因的框移突变 （frame shift mutation）。
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
b.多聚酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction），在试管内扩增一个特定 基因组片断的一个方法。
4. E.coli 三种DNA聚合酶的比较
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
以上两个过程复制和校对，都依赖碱基
配对中的非共价相互作用，这是提高信 息分子复制高保真度的根本方法。
六. 大肠杆菌有多种DNA聚合酶
1. DNA polymerase I 的特性
5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性；
5’－3’外切酶活性。
l DNA合成速度不及复制叉移动速度的 1/20，16-20 nt/s；
c. DNA复制是半不连续的；
I. 冈崎片断（Okazaki fragments）；
II. 复制叉上的前导链（leading strand）和 滞后链（lagging strand）；
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DNA复制,修复和重组
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DNA复制,修复和重组
DNA重组技术PPT课件
为倒置重复序列，如HindIII, AAGCTT。
17
酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
15
限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
14
限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。
6
① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
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酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
14
限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。
6
① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
《DNA重组》幻灯片
2. 插入序列结构特征：
2. 插入序列结构特征：
（1）它们都是小的DNA片段（约1kb ）
（2）两端有反向重复序列（inverted repetitive sequence, IR）
（3）除了IS1以外，所有已知IS序列都只有一个
开放读码框，具有编码转座酶的基因。
（4）转座时往往复制宿主靶位点一小段（415bp）DNA，形成位于IS序列两端的正向重复 区。
（１）转座依赖转座酶。 （２）转座因子两端有被转座酶识别的反向重复序列。 （３）转座的靶位点是随机的，靶位点交错切开，插入 转座因子后经修复形成两侧正向重复序列。
１．不同点：
（１）真核细胞内只要存在转座酶，任何具有该酶识 别的反向重复序列的DNA片断均可以转移，而无需 由被转移序列自身编码这种酶。
者在重组中起的作用不同） 二者有共同的核心序列（O区）长度为15bp。
2．酶及蛋白质：
整合是由λDNA编码的λ重组酶完成的，称为λ整合酶 （λintegrase, Int）。
在反应过程中涉及几种辅助蛋白，这些蛋白有些是寄 主编码的，如宿主编码的整合宿主因子（integration host factor, IHF）
二、λ噬菌体DNA 的整合与切除
（一）简介
当λDNA进人大肠杆菌细胞时，一种复杂的调控系统 使得DNA采取两种命运中的一种：
1．溶菌（裂解）周期：λDNA独立存在，进行大量 复制以产生更多的子代噬菌体，在这种情况下，它最 后破坏寄主细胞，释放子代噬菌体；
2．溶原周期：λDNA整合进寄主染色体，随着寄主 染色体复制而一代代传下去。整合到细菌DNA中的 λDNA被称为前病毒。
（3）它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一核
苷酸上；在高等生物细胞中，专一抗体基因的多样性即是通 过一组前体序列的位点特异重排构建的。
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（一）特异位点重组类型：
• 重组的结果取决于重组位点的方向和位置： (1) 重组位点若同向、位于同一DNA分子上 切除
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15
（2）重组位点同向、位于不同DNA分子上 整合
• 例如：-噬菌体的整合与切除
-噬菌体 DNA
整合酶 + 整合因子
B
B O
P O B
B O P
P O P 细菌DNA
片段重组11 体
• Meselson M 和 Radding C修正模型：
• DNA双链断裂启动重组，也启动了减数分裂
• 同源重组是最基本的重组方式，参与基因加工、整合、转化等
• 参与复制、重组、重组修复三个相关过程的许多酶和辅因子是 共同的
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12
（二） 重组有关的酶：
• Rec BCD蛋白:
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10
一 同源重组（homologous recombination)
• 同源重组：一般性重组，由两条同源DNA，通过配对、 断链、再连接过程，而产生片段交换的过程。
（一）Holliday 模型： 1964年提出
Holliday中间体
异源双链区两侧为 不同亲本DNA
精选课件拼ppt接重组体
与断裂DNA末端结合，水解其中一条链，识别chi位点 （GCTGGTGG），并在其3’侧4~6nt处切割产生3’-OH末端 DNA单链。是依赖ATP的核酸外切酶、解螺旋酶和被ATP增 强的内切酶。
• Rec A蛋白：解螺旋酶；重组酶；ATP酶
促进单链同化（促使单链与同源双链分子交换，5’ 3’）
诱发SOS反应
3’-OH
Rec A
Ruv A Ruv B
Ruv A Ruv B
Ruv C
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14
二 特异位点重组 (site-specific recombonant)
• 特异位点重组：在重组酶的识别和作用下，在DNA特定 的短序列（20 ~200bp）内发生的重组。
• 发生：某些基因表达的调节、发育过程中DNA程序性重排、 病毒或质粒复制过程中的整合或切除等
第二节 DNA突变
• DNA突变（mutation）：指DNA分子结构变异
一 突变类型：
1. 转换（transition）：两种嘌呤（嘧啶）互换 2. 颠换（transvertion）：嘌呤(嘧啶)与嘧啶（嘌呤）互换
• 点突变：只有一个碱基被取代。结果只造成所编码蛋白质
中一个氨基酸的变异。
3. 插入（insertion）：一个或多个碱基插入DNA序列中。
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4
• 光复活（photoreactive repair） ：
~400nm可见光
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5
① 碱基切除修复
三 切除修复：
• 在一系列酶 作用下，DNA 中损伤部分切 除，并以完整 链为模板，合 成切除部分的 修复方式。
无碱基的 “AP”位 点
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② 核苷酸切除修复
6
四 重组修复：
• Ruv A：识别Holliday联结体的交叉点
• Ruv B：解螺旋酶，在Ruv A帮助下结合在交叉点上，形成
Ruv AB复合体，推动分支移动。
• Ruv C：核酸内切酶，特异识别Holliday联结体，识别不对称
四核苷酸ATTG（切开热点）
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13
（三）同源重组的过程
Rec BCD
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2
（2）化学诱变剂：
• 碱基类似物： 酮式：与A配对
5-溴尿嘧啶(BU)等 烯醇式：与G配对
• 碱基修饰剂： 亚硝酸：使碱基脱氨。AI，与A、C、U配对 氮芥：烷化剂，形成链内（间）G二聚体，GG 亚硝基胍：烷化剂，可控制突变位点。
• 嵌入染料：溴乙啶（EB）；吖啶橙等扁平分子， 可插入碱基对之间，导致移码突变
非3的整数倍时，产生移码突变。
4. 缺失（deletion）：一个或多个碱基缺失造成的突变。
也可产生移码突变。
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1
二 诱变剂作用：
• 自然突变：自然条件下产生的突变。突变率很低。 • 诱变：采用物理或化学因子导致的突变。 • 诱变剂（mutagen）：致诱变的理化因子。
（1）物理诱变剂： 紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体，TT、CT和CC X-射线、 -射线: 高能射线直接引发突变 电离辐射产生自由基，间接导致突变
切除
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信息的重新组合。也称为基因重排（gene rearrangement)。 • 重组体DNA （recombinant DNA） • 重组现象存在广泛，真核生物重组一般发生在减数分裂时 • 重组类型：同源重组、特异位点重组和转座重组等 • 作用：迅速增加生物群体遗传多样性 • 突变和遗传重组是自然选择的前提条件
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3
第三节 DNA的损伤修复
一 错配修复（mismatch repair）：
DNA复制发生错配时，错配修复系统启动， 通过识别复制起点（ori C）处GATC序列是否被 甲基化而找出新链，将新链水解后重新合成。
二 直接修复（direct repair）：
光复活修复紫外线照射引起的胸腺嘧啶二聚 体 TT 或 CT 、CC等。
• 由SOS反应诱导的DNA损伤修复系统：
（1）避免差错系统：光复活、切除修复和重组 修复等，修复时不引入差错。
（2）错误倾向修复；产生缺乏校对功能的DNA 聚合酶IV和V （pol IV和pol V）。
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8
未诱导的细胞
• SOS反应的机制
LexA(阻遏物40个不同的位点被阻遏）
• 从同源DNA母链上将 相应序列重组交换到 子链的缺口处，再弥 补母链空缺的修复方 式。
• 重组修复结果，损伤 并未切除，随传代而 “稀释”了。
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7
五 应急反应（SOS）和易错修复：
• 应急反应（SOS respones）： 细胞DNA受到损伤或复制系统受抑制的紧急
情况下，为求得生存而出现的包括诱导DNA损伤 修复、诱变效应、细胞分裂抑制等多种反应。
lexA基因被LexA
蛋白部分阻遏
诱导的细胞
RecA促使LexA 自身分解
recA基因被LexA
蛋白部分阻遏
单链DNA ATP
靶基因表达
lexA靶基因表达 但产物精被选课分件p解pt
recA大量表达
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第四节 DNA的遗传重组
• 遗传重组（genetic recombination ): DNA分子内或分子之间以各种不同方式和机制发生遗传
• 重组的结果取决于重组位点的方向和位置： (1) 重组位点若同向、位于同一DNA分子上 切除
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（2）重组位点同向、位于不同DNA分子上 整合
• 例如：-噬菌体的整合与切除
-噬菌体 DNA
整合酶 + 整合因子
B
B O
P O B
B O P
P O P 细菌DNA
片段重组11 体
• Meselson M 和 Radding C修正模型：
• DNA双链断裂启动重组，也启动了减数分裂
• 同源重组是最基本的重组方式，参与基因加工、整合、转化等
• 参与复制、重组、重组修复三个相关过程的许多酶和辅因子是 共同的
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（二） 重组有关的酶：
• Rec BCD蛋白:
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一 同源重组（homologous recombination)
• 同源重组：一般性重组，由两条同源DNA，通过配对、 断链、再连接过程，而产生片段交换的过程。
（一）Holliday 模型： 1964年提出
Holliday中间体
异源双链区两侧为 不同亲本DNA
精选课件拼ppt接重组体
与断裂DNA末端结合，水解其中一条链，识别chi位点 （GCTGGTGG），并在其3’侧4~6nt处切割产生3’-OH末端 DNA单链。是依赖ATP的核酸外切酶、解螺旋酶和被ATP增 强的内切酶。
• Rec A蛋白：解螺旋酶；重组酶；ATP酶
促进单链同化（促使单链与同源双链分子交换，5’ 3’）
诱发SOS反应
3’-OH
Rec A
Ruv A Ruv B
Ruv A Ruv B
Ruv C
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二 特异位点重组 (site-specific recombonant)
• 特异位点重组：在重组酶的识别和作用下，在DNA特定 的短序列（20 ~200bp）内发生的重组。
• 发生：某些基因表达的调节、发育过程中DNA程序性重排、 病毒或质粒复制过程中的整合或切除等
第二节 DNA突变
• DNA突变（mutation）：指DNA分子结构变异
一 突变类型：
1. 转换（transition）：两种嘌呤（嘧啶）互换 2. 颠换（transvertion）：嘌呤(嘧啶)与嘧啶（嘌呤）互换
• 点突变：只有一个碱基被取代。结果只造成所编码蛋白质
中一个氨基酸的变异。
3. 插入（insertion）：一个或多个碱基插入DNA序列中。
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• 光复活（photoreactive repair） ：
~400nm可见光
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① 碱基切除修复
三 切除修复：
• 在一系列酶 作用下，DNA 中损伤部分切 除，并以完整 链为模板，合 成切除部分的 修复方式。
无碱基的 “AP”位 点
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② 核苷酸切除修复
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四 重组修复：
• Ruv A：识别Holliday联结体的交叉点
• Ruv B：解螺旋酶，在Ruv A帮助下结合在交叉点上，形成
Ruv AB复合体，推动分支移动。
• Ruv C：核酸内切酶，特异识别Holliday联结体，识别不对称
四核苷酸ATTG（切开热点）
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（三）同源重组的过程
Rec BCD
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（2）化学诱变剂：
• 碱基类似物： 酮式：与A配对
5-溴尿嘧啶(BU)等 烯醇式：与G配对
• 碱基修饰剂： 亚硝酸：使碱基脱氨。AI，与A、C、U配对 氮芥：烷化剂，形成链内（间）G二聚体，GG 亚硝基胍：烷化剂，可控制突变位点。
• 嵌入染料：溴乙啶（EB）；吖啶橙等扁平分子， 可插入碱基对之间，导致移码突变
非3的整数倍时，产生移码突变。
4. 缺失（deletion）：一个或多个碱基缺失造成的突变。
也可产生移码突变。
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二 诱变剂作用：
• 自然突变：自然条件下产生的突变。突变率很低。 • 诱变：采用物理或化学因子导致的突变。 • 诱变剂（mutagen）：致诱变的理化因子。
（1）物理诱变剂： 紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体，TT、CT和CC X-射线、 -射线: 高能射线直接引发突变 电离辐射产生自由基，间接导致突变
切除
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信息的重新组合。也称为基因重排（gene rearrangement)。 • 重组体DNA （recombinant DNA） • 重组现象存在广泛，真核生物重组一般发生在减数分裂时 • 重组类型：同源重组、特异位点重组和转座重组等 • 作用：迅速增加生物群体遗传多样性 • 突变和遗传重组是自然选择的前提条件
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第三节 DNA的损伤修复
一 错配修复（mismatch repair）：
DNA复制发生错配时，错配修复系统启动， 通过识别复制起点（ori C）处GATC序列是否被 甲基化而找出新链，将新链水解后重新合成。
二 直接修复（direct repair）：
光复活修复紫外线照射引起的胸腺嘧啶二聚 体 TT 或 CT 、CC等。
• 由SOS反应诱导的DNA损伤修复系统：
（1）避免差错系统：光复活、切除修复和重组 修复等，修复时不引入差错。
（2）错误倾向修复；产生缺乏校对功能的DNA 聚合酶IV和V （pol IV和pol V）。
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未诱导的细胞
• SOS反应的机制
LexA(阻遏物40个不同的位点被阻遏）
• 从同源DNA母链上将 相应序列重组交换到 子链的缺口处，再弥 补母链空缺的修复方 式。
• 重组修复结果，损伤 并未切除，随传代而 “稀释”了。
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五 应急反应（SOS）和易错修复：
• 应急反应（SOS respones）： 细胞DNA受到损伤或复制系统受抑制的紧急
情况下，为求得生存而出现的包括诱导DNA损伤 修复、诱变效应、细胞分裂抑制等多种反应。
lexA基因被LexA
蛋白部分阻遏
诱导的细胞
RecA促使LexA 自身分解
recA基因被LexA
蛋白部分阻遏
单链DNA ATP
靶基因表达
lexA靶基因表达 但产物精被选课分件p解pt
recA大量表达
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第四节 DNA的遗传重组
• 遗传重组（genetic recombination ): DNA分子内或分子之间以各种不同方式和机制发生遗传