PCR体系优化(新)
PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化
PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR虽然为一个简单的实验,但在实际过程中可能会出现各种问题.产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量，PCR反应过程中各种试剂的含量,以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下.当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除,并不断的摸索才能彻底解决.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改.酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
PCR体系优化
由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该酶的PCR反应体系。
A 镁离子浓度镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要.模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量.如果游离的镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能(figure1)。
过多的游离镁离子则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增.因此，研究者应当根据实际的实验结果来优化每一反应中镁离子的浓度。
可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为1～4mM，每次增加或降低0。
5~1 mM。
扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。
最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如,Pfu DNA 聚合酶似乎对镁离子的依赖性更低,但其优化范围通常为2~6mM.许多DNA聚合酶产品提供Mg—free reaction buffer和单独一管25mM MgCl2，这样就可以自行调节Mg2+浓度，优化反应体系。
MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层,为获得均一的溶液，在配液的时候，要确保MgCl2溶液完全溶解并充分震荡混匀。
非常简单的两步,溶解和混匀，常常会造成实验失败。
有些科学家倾向于使用包含MgCl2的buffer,MgCl2的终浓度为1。
5mM.值得注意的是有文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM 的变化，如果在90℃加热10min,则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。
Figure 1.镁离子浓度对PCR扩增的影响。
用不同浓度Mg 2+测试，产物大小为1。
8kb琼脂糖凝胶电泳,EB染色泳道M为MAKER；Lane 1，0mM Mg 2+ ; Lane 2, 0。
5mM Mg 2+ ;Lane 3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1。
PCR技术操作程序和优化方法
PCR技术操作程序和优化方法PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是在生物学研究、医学诊断和基因工程等领域广泛应用的一种分子生物学技术。
PCR技术的操作程序和优化方法对于实验结果的质量和准确性起到至关重要的作用。
1.样品准备：收集样品并保持其完整性和纯度，如血液、组织、细胞等。
对于一些样品，可能需要经过一定的处理步骤，如细胞裂解、DNA提取等。
2.DNA模板扩增：将所需扩增的目标DNA分子加入PCR反应体系中作为DNA模板。
可以是基因组DNA、cDNA或已知序列DNA等。
3.引物设计和合成：设计并合成两个与目标DNA序列两端互补的DNA 引物。
引物的末端一般要加入辅助序列，如限制性内切酶切位点、荧光染料、标记物等。
4.PCR反应体系的配制：根据反应所需的材料类型和浓度计算PCR反应的总体积，并将各种试剂按照计量摔入试管中。
反应体系由DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液、酶稳定剂等组成。
5.PCR循环：PCR反应一般包括3个步骤：变性、退火和延伸。
PCR 循环通常包括以下几个步骤：变性，将反应体系中的DNA模板变性为单链状态；退火，使两个互补的引物与DNA模板互补结合；延伸，通过DNA聚合酶将新的DNA链合成。
6.PCR循环程序：PCR反应可以采用恒温PCR或温度梯度PCR。
恒温PCR循环通常设置在94-96℃的高温变性步骤和50-72℃的低温退火和延伸步骤之间进行切换。
温度梯度PCR则是在每一个PCR循环中，通过温度梯度的方式调节退火步骤的温度，以确定最佳退火温度。
7.PCR循环次数：PCR循环的次数通常为20-40次。
循环次数过低会导致DNA浓度不足，循环次数过多会增加非特异性产物的生成。
8.PCR产物分析：通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分离和检测，可以对所进行的PCR反应进行验证和分析。
1.引物设计与优化：选择合适的引物序列是PCR反应成功的重要因素之一、引物的长度一般在18-30个核苷酸之间。
真菌检测的PCR技术优化
真菌检测的PCR技术优化随着科技的不断发展，分子生物学技术被广泛应用于医学、生命科学、农业、环保等领域。
其中，聚合酶链反应（PCR）技术作为一种快速、敏感的检测手段，被广泛应用于微生物检测领域。
然而，在真菌检测方面，PCR技术的敏感性和特异性仍然存在一定的局限性，因此需要进行技术优化。
一、基本原理PCR技术是一种体外人工扩增DNA序列的方法，主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性使DNA双链解开，退火时引入引物使序列与目标DNA互补结合，而延伸即是DNA聚合酶利用引物为模板合成新的DNA链。
通过这些步骤的不断重复，可以在短时间内将目标DNA扩增数百万甚至数千万倍，从而达到检测的目的。
二、真菌检测PCR技术的优化策略1. 引物的设计引物设计是影响PCR技术特异性和敏感性的重要因素之一。
对于真菌检测，通常选择ITS区（Internal Transcribed Spacer）作为靶标，ITS区序列特异性高，同时在不同真菌之间表现出一定的变异性，可用于真菌检测。
引物的长度和序列是影响扩增效率和特异性的另一个因素。
引物过短可能导致扩增效率低下，而引物过长可能会影响特异性和扩增效率。
引物序列应选择在靶标区域内，且在该区域内没有其他物种存在。
2. 技术参数的优化PCR技术需要很多参数的配合才能达到最佳表现。
其中包括反应体系的成分、反应温度和时间等方面。
反应体系中包含的成分一般包括模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶、缓冲液等，各成分的质量和浓度的配比都需要精确控制。
在增加反应特异性方面可以增加比例相对较高的引物，而在增加扩增效率方面可以增加dNTP和酶的浓度。
反应体系中的缓冲液是在PCR反应中起缓冲和稳定pH值等作用的，而该液的组分和pH值的选择对PCR反应的效果有着直接的影响。
因此，在实验中选择适合特定反应的缓冲液至关重要。
反应温度和时间也是影响PCR技术特异性和敏感性的重要参数之一，通常包括变性、退火和延伸三个步骤。
PCR技术的新进展
基因组学研究
基因组测序
PCR技术是基因组测序的关键步骤之一，用 于合成更长的DNA片段，提高测序的准确 性和覆盖率。
基因组编辑
基于PCR技术的基因组编辑技术如CRISPRCas9，能够实现对特定基因的敲除、插入 和修复，为遗传疾病治疗和农作物改良提供 可能。
05
pcr技术的未来展望
pcr技术的改进与创新
02
新一代pcr技术
数字pcr
数字PCR是一种高灵敏度和高特异性的绝对定量技术，通过将待测样本分成大量独立的反应单元，每 个单元中包含一个或多个起始分子，进行独立扩增，通过计数每个反应单元中阳性与阴性结果的个数 ，计算出待测样本中目标分子的数目。
数字PCR具有高灵敏度、高分辨率和高准确性的特点，能够检测单拷贝基因，适用于稀有基因变异、 低丰度基因表达以及突变负荷的检测等。
基因表达
PCR技术可用于检测基因在不同组织或发育阶段的表达情况，有助于理解基因在生命过 程中的作用。
基因突变研究
突变检测
PCR技术能够检测DNA序列中的突 变，包括点突变、插入和缺失等，为 遗传病研究和药物研发提供有力工具 。
突变定位
通过PCR扩增和测序，可以精确定位 突变位点，为遗传咨询和产前诊断提 供依据。
实时PCR是一种实时监测PCR扩增过程的检测技术，通过在 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的变化 实时监测PCR扩增过程。
实时PCR具有高灵敏度、高特异性和可重复性强的特点，能 够实现自动化操作，广泛应用于基因表达分析、病原体检测 和基因突变研究等领域。
逆转录pcr
逆转录PCR是一种将RNA逆转录为 cDNA再进行PCR扩增的技术，用于 检测细胞或组织中特定基因的表达水 平。
PCR实验室质量体系(第4版)0000
PCR实验室质量体系(第4版)0000引言PCR（聚合酶链式反应）实验室是进行核酸分析的重要场所。
为了确保实验室的质量和准确性，建立一个完善的质量体系是必要的。
本文档旨在介绍PCR实验室的质量体系，包括质量管理体系的建立和维护，实验方法的标准化，以及实验室设备和材料的质量控制等内容。
质量管理体系的建立质量管理体系是实验室管理的基础，可以确保实验室的工作能够按照规范进行，并提供可靠和准确的结果。
以下是PCR实验室建立质量管理体系的关键步骤：1. 制定质量管理政策质量管理政策应包括实验室的质量目标和承诺，以及质量管理体系的执行责任。
该政策必须被实验室的管理层和所有员工积极支持和执行。
2. 编写操作手册操作手册是记录实验室工作指导和标准操作程序的重要文件。
它应涵盖实验流程、实验方法、实验设备的使用方法以及质量控制措施等方面的细节。
3. 建立标准操作程序标准操作程序是实验室工作的规范，包括实验准备、样本处理、PCR反应设置和结果分析等方面的步骤和要求。
所有员工都应按照标准操作程序进行工作。
4. 质量培训和认证为了确保员工具备必要的技能和知识，实验室应定期进行质量培训。
培训内容包括实验方法、质量控制和安全操作等方面。
此外，员工还应获得相关证书，以证明其在PCR实验室操作方面的能力。
5. 内部审核和改进实验室应定期进行内部审核，以检查质量管理体系的有效性和符合性。
审核的结果应用于改进实验室的工作流程和流程，确保实验室持续改进。
实验方法的标准化PCR实验室中使用的方法和实验流程应尽可能标准化，以确保实验的可重复性和准确性。
以下是一些实现方法标准化的关键要点：1. 基础设施和设备实验室的基础设施和设备应达到一定的标准和规范。
实验室应具备适当的环境控制措施，如温度控制和洁净度。
实验设备应定期维护和校准，确保其正常运行和结果的准确性。
2. 样本处理和前处理样本处理和前处理是PCR实验的重要步骤。
为了确保样本的质量和准确性，应建立标准的操作程序。
优化pcr体系的方法
优化pcr体系的方法
优化PCR体系的方法有：
1. 优化引物设计：选择合适的引物序列，优化引物的浓度和比例，确保引物的特异性和互补性。
2. 优化反应条件：合理调整PCR反应的温度、时间和环节，比如优化退火温度、延长扩增时间等，以提高反应效率和特异性。
3. 优化酶的选择：选择适合的DNA聚合酶和其缓冲液，以提高PCR反应的效率和特异性。
4. 添加辅助物质：如DMSO、BSA等，可以改变反应体系的离子平衡，降低引物间的二级结构，增强PCR效果。
5. 优化反应体系中其他组分的浓度：如优化模板DNA、引物和dNTP等的浓度，以提高PCR反应的效率和特异性。
6. 引入热启动酶或热稳定酶：可以在PCR反应开始前抑制非特异性扩增，提高PCR的特异性。
7. 优化反应体系的pH值：调整PCR反应的pH值，使其适合DNA的变性和扩增过程。
8. 引入分析验证环节：如添加内参物质或设计阳性对照，进行验证实验，检测PCR反应的特异性和准确性。
9. 优化PCR反应后处理：如优化PCR产物的纯化方法、提高PCR产物的检测灵敏度，以提高PCR实验的质量和效果。
PCR扩增反应综合分析与性能改善方法研究
PCR扩增反应综合分析与性能改善方法研究PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、基因克隆、病原体检测等领域。
然而，PCR扩增反应在实际应用中存在一些问题，如低特异性、低扩增效率、扩增产物污染等，因此需要开展综合分析与性能改善方法的研究，以提高PCR的可靠性和准确性。
首先，对PCR扩增反应进行综合分析十分重要。
我们可以从以下几个方面进行综合分析：1. 反应体系优化：PCR反应体系的优化对提高扩增效率和特异性具有重要作用。
反应体系包括引物浓度、酶浓度、模板浓度、缓冲液配方等。
通过优化这些参数，可以减少非特异性扩增产物的产生，提高特异性。
2. 引物设计优化：引物是PCR反应的重要组成部分，其特异性和合适的长度对PCR扩增反应的准确性至关重要。
引物设计时可以借助生物信息学工具进行，确保其与目标序列的互补性和特异性。
另外，通过引物设计中的修饰，如添加磷酸基团或化学修饰物等，可以增加引物的特异性和扩增效率。
3. PCR条件优化：PCR反应的条件优化也是提高扩增效率和特异性的重要步骤。
包括反应温度、时间、循环数等。
通过优化反应条件，可以减少非特异性扩增产物的产生，提高PCR反应的特异性和准确性。
另外，还可以通过使用热启动酶、热稳定酶等专门设计的酶来提高PCR反应的特异性和扩增效率。
在进行PCR扩增反应性能改善时，以下几种方法可供参考：1. 增加模板DNA浓度：模板DNA浓度是影响PCR反应效果的关键因素之一。
适当增加模板DNA浓度可以提高扩增效率和特异性。
2. 增加引物浓度：引物浓度的适当调整也对PCR反应的性能改善有效。
增加引物浓度可以增加扩增效率和特异性。
3. 预处理样品：PCR反应中常常伴随着目标DNA以外的非特异性扩增产物的产生。
通过预处理样品，如DNA提取、酶切消化等，可以减少非特异性扩增产物的形成，提高PCR反应的特异性。
4. 寻找更合适的引物：有时，PCR扩增反应的性能不佳可能与引物的选择有关。
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29.854
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10u/test 20u/test 30u/test 40u/test 50u/test NTC
RNA酶抑制剂浓度的优化
比较了四个浓度： 24 U/T 12 U/T 8 U/T 4 U/T
高浓度RNA
低浓度RNA
优化前后含量对比
成分
作用
上游引物 下游引物
探针
DNA正链扩增引物
为什么用Ct值定量而不用 终点相对荧光强度定量
实时荧光PCR是如何定量？
在一定范围:
1
Ct值∝ lg C
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起 始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得 未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
PCR检测过程
42度，60分钟 逆转录
42度，45分钟 逆转录
95度，3分钟 预变性
95度，30秒 变性
50个循环
55度，20秒 退火
95度，3分钟 预变性
45个循环
95度，10秒 变性 58度，45秒 退火 延伸
72度，20秒 延伸
优化前后的比较
优化前
优化后
多色荧光PCR
• 双色荧光PCR • 三色荧光PCR • 多色荧光PCR
RNA逆转录和DNA负链 扩增引物
与模板杂交，发送信号
Taq酶
合成双链DNA
dNTP
为模板复制提供原料
镁离子
支持Taq酶活性
逆转录酶
将RNA逆转录成cDNA
RNA酶抑制剂
防止RNA降解
扩增缓冲液
提供稳定的反应环境
优化前浓度
0.15uM 0.15uM 0.15uM 1.2U/T 20uM/T 1.5mmol 30U/T 12U/T pH8.6
PIR
National Biomedical Research Foundation
PRF
Protein Research Foundation, Japan
PDB
Research collaboratory for Structural bioinformatics
www.ddbj.nig.ac.jp www.expasy.ch www.prf.or.jp
双色荧光PCR
FAM
JOE
不加内标（单色PCR) 加人内标 (双色PCR）
三色荧光PCR
FAM
HEX
Texas－Red
多色荧光PCR应注意的几个问题
1、反应原料问题
Taq E， d NTP ， 逆转录酶等
HBV
2、引物扩增问题
HVB HCV HIV
HIV
HCV
3、探针设计问题
Thank you!
优化后浓度
0.15uM 0.6uM 0.6uM 2U/T 20uM/T 2.5mmol 20U/T 12U/T pH8.6
反应程序的优化
逆转录时间的比较
45min
逆转录时间（30min；45min；60min ）
反应程序的优化
RT-PCR扩增程序优化
RT-PCR扩增程序（优化前）
RT-PCR扩增程序（优化后）
GenBank
National Center for Biotechnology Information
EMBL
European Bioinformatics Institute
DDBJ
National Institute of Genetics, Japan
SWISS-PROT Swiss Institutes of Bioinformatics
样
结
品 处 理
PCR 扩 增
果 检 测
Real time PCR
实时荧光定量PCR优化目标
1、Ct值
2、ΔRn值
3、R值
优化内容
HCV
➢引物设计和筛选 ➢探针设计和筛选 ➢反应体系的优化 分子信标 ➢反应程序的优化
引物的设计与筛选1
序列查找与比对
附：主要数据库的网址
数据库
组织
网址
MEDLINE National Library of Medicine
多色荧光PCR的特点
①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物， 或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可 检测多种病原体.
②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病 毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌 及细菌战剂的同时侦检.
③经济性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的 节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准 确的诊断信息.
Mg2+和退火温度的优化
--------(方阵法）
PCR促进剂的影响
AMV与M-MLV的比较
AMV M-MLV
M-MLV的用量的优化
F5 F6
Well Ct
F1
27.373
F2
30.291
F5
26.144
F6
29.143
G1
26.205
G2
29.896
G5
26.221
G6
29.661
H2
26.279
探针用量的优化
0.6uM 0.3uM 0.15uM
反应体系的优化1
不同Taq E的比较
Taq 1 Taq 2
反应体系的优化2
Taq E浓度的优化
0.5 U/T 2.0 U/T
1.0 U/T 3.0 U/T
反应体系的优化3
dNTP浓度的优化
10uM/T 40uM/T
20uM/T 80uM/T
Mg2+对荧光强度的影响
荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR
程扬健 厦门大学生命科学院分子诊断实验室
认识它们吗？！
什么是Ct值和Δ Rn？
(S/B)
Ct
Ct值中的C代表循环数（Cycle），t代表域值（threshold）， Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数。 Δ Rn: 相对荧光强度
CSD
Cambridge Crystallographic Data Center
引物的设计与筛选2
二级结构分析
条件： 42℃；50mM Na+; 2.5mM Mg2+
/~zukerm/rna/
引物的设计与筛选3
引物设计
5’
3’
HCV 5’ UTR
HCV
引物的设计与筛选4 引物筛选结果
1
2
3
4
5
引物的设计与筛选5
引物用量的优化
不对称PCR（S/A=1：4）Vs 对称PCR（S/A=1：1）
探针设计和 筛选1
探针设计
探针设计和 筛选2
探针的Tm值
探针设计和 筛选3
退火温度的确定
＋
探针设计和 筛选4