Trizol法提取RNA实验步骤与原理(新手详细注释版)
Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤
Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA 只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
(完整版)Trizol法提取RNA实验步骤.doc
Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA 质量的高低常常影响 cDNA 库， RT-PCR和 Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（ RNase-free）、 Tips（ RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
用用 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取时必须戴手套。
一般情况下采RNase-free 的物品1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC使 DEPC的终浓度为 0.1%。
注意： DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将 DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizoｌ法使用步骤一、分离纯化得基本原理研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。
ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。
Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。
二、用户需自备得试剂与材料无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)三、准备工作RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。
它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。
用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。
它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。
RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。
取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。
1、料制品得处理尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下:1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。
注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。
2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。
3)在通风柜中室温处理过夜。
4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻与金属物品250°C烘烤3小时以上。
Trizol-法提取RNA实验步骤
Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizolxx使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCF和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、 1.5ml Eppendof管（RNase- free ）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的咼温咼压蒸气火菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂）配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)一、实验步骤1. 涂布区域准备- 确保实验室台面干净整洁，并消毒工作区域。
- 准备所需的试剂和材料，包括Trizol试剂、异丙醇、70%乙醇、无菌乙酸纯水等。
2. 细胞样本处理- 从培养皿中收集所需的细胞样本，注意避免污染。
- 使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和细胞碎片。
- 加入适量的Trizol试剂至细胞样本中，充分悬浮细胞。
- 注意：为了保护RNA的完整性，在细胞样本处理过程中尽量迅速操作，避免长时间接触Trizol试剂。
3. 提取RNA- 将含有细胞样本和Trizol试剂的混合物转移到无菌离心管中。
- 加入适量的氯仿，摇匀混合，并静置15分钟，使混合物体相分离。
- 低速离心10分钟，将上层的无色透明液体转移到新的无菌离心管中。
4. 分离RNA- 加入等体积的异丙醇，轻轻倾斜离心管，使RNA沉淀形成。
- 低速离心10分钟以沉淀RNA，上清液中通常含有DNA。
- 倒掉上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以洗涤RNA。
- 低速离心5分钟，倒掉乙醇。
5. 干燥RNA- 用洗涤过的无菌乙酸纯水溶解RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以溶解RNA。
- 将溶解的RNA转移至无菌离心管中。
- 在室温或37摄氏度下迅速干燥RNA，避免长时间曝露。
6. 储存RNA- 使用RNase-free水溶解RNA沉淀，测定RNA的浓度和纯度。
- 分配等量的RNA至多个RNase-free离心管中，储存在-80摄氏度的冰箱中。
二、实验原理Trizol法是一种常用于提取RNA的方法，其原理如下：1. 细胞破裂- Trizol试剂能够迅速破坏细胞膜，使细胞释放出RNA。
- Trizol试剂中含有酚和氯仿，酚用于破坏脂质，氯仿用于改变混合物的密度，从而使RNA与其他细胞成分分离。
2. 分离RNA- 经过破裂后，细胞内的DNA、RNA和蛋白质等成分被混合在一起，形成上清液。
trizol法提取rna的原理
trizol法提取rna的原理
Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理基于三种物质的作用：酚、异硫氰酸盐和氯仿。
这三种物质能够分别破坏细胞膜、蛋白质和DNA，从而将RNA释放出来。
具体步骤如下：
1. 细胞样品裂解
将细胞样品加入Trizol试剂中，通过离心等方式使细胞裂解，并释放出RNA。
2. 蛋白质沉淀
加入氯仿并离心，使细胞蛋白质沉淀到底部形成一个有机相。
3. RNA沉淀
将上层的水相转移至新管中，并加入异硫氰酸盐。
异硫氰酸盐能够溶解RNA，使其在水相中存在。
4. RNA纯化
通过离心等方式将RNA从水相中分离出来，并使用乙酸等试剂对其进行纯化和去除杂质。
最终得到的RNA可以用于后续实验，如逆转录PCR、Northern blotting等。
需要注意的是，在Trizol法提取RNA时要严格控制操作条件，避免污染和失去RNA。
同时也需要对不同类型的样品进行优化，以获得最佳的RNA提取效果。
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Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品
的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品
250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
（液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。
终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应）
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。
另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总RNA
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。
有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相）
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇（沉淀RNA）混匀，室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。
注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul H
2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。
注：H
2
O、
TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
（TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA。
用于酶切反应不能使用SDS）
12、测O.D值定量RNA浓度。
注：此方法提取RNA A
260/A
280
值在1.6-1.8之间；产率
估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。
注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；
高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；
热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；
组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。
6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法
①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；
②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
③取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
④取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；
⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；
⑥弃上清后，室温干燥5-7mins；
⑦加入适量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存，检测RNA浓度，并电泳检测。
6.1.2.2 RNA浓度测定和电泳检测
取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。
电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。
6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成
反应按照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser （Perfect Real Time) 反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。
①（残存的）基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。
试剂用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl
gDNA Eraser 1.0 μl
Total RNA X* ul
O up to 10 μl
RNase Free dH
2
（gDNA、genomic DNA、基因组DNA：是指有机体在单倍体状态下的DNA全部含量，是染色体DNA，与质粒等染色体外DNA区别。
）
X*：根据检测到的RNA浓度来配置；
混合均匀后，室温放置20-30min
②反转录反应，在PCR管中配置如下缓冲液（20ul system），反应液配制在冰上进行。
为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制Master Mix ，然后再分装到每个反应管中。
试剂使用量
5×PrimeScrip t® Buffer 2（for
4.0 ul
Real Time）
PrimeScript® RT Enzyme Mix I 1.0 μl
RT Primer Mix 1.0 μl
①的反应液10.0 ul
RNase Free dH
O up to 20 μl
2
③混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：
37℃ 15 min
85℃ 5 sec
然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。