植物RNA提取步骤
RNA试剂盒提取步骤
常规植物样品总RNA小量抽提1. 植物样品的研磨。
�收集植物样品并尽快浸泡到液氮中以防止RNA 的降解。
使用研钵、研磨棒和液氮将植物样品研磨成尽量细小的粉末。
RNA 的产量取决于样品类型和研磨效果。
注：研磨后的植物粉末可直接保持于-70°C。
�快速称取50-100mg 的研磨好的植物样品至1.5ml 预冷的离心管中。
注：在加入裂解液之前，不要让样品解冻。
初次使用时，推荐先使用50mg，待取得理想结果后，再酌情提高用量。
2. 立即加入500µlBuffer RL/β-ME混合液至样品中。
立即于最高速度涡旋30-60 秒充分打散样品，室温静置3-5 分钟让样品充分裂解。
注：使用前分装适量的Buffer RL，每1ml Buffer RL 加入20µl β-疏基乙醇(β-ME)或2M DTT。
若植物用量增加超过100mg，按比例增加Buffer RL/2-ME 的用量。
3. 室温下，14,000 x g 离心5 分钟。
4. 把gDNA 过滤柱装在2ml 收集管中。
把第三步的上清液转移至gDNA过滤柱中。
14,000 x g 离心1 分钟。
5. 弃去gDNA 过滤柱。
加入0.5倍体积无水乙醇(~250µl)至滤液中。
用移液枪吸打3-5次混匀。
6. 把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管中。
转移第5 步的混合液至RNA柱子中。
10,000 x g 离心30-60 秒。
7. (可选)这一步可插入DNase 进行膜上消化。
(请另外订购DNase On Column Kit 进化膜上DNase 消化)。
8. 倒弃滤液，把柱子装在收集管中。
加入500µl Buffer RW1 至柱子中。
10,000 x g离心30-60 秒。
9. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。
加入600µl Buffer RW2 (已用乙醇稀释)至柱子中。
10,000 ×g 离心30-60 秒。
植物RNA提取方法
RNA提取方法1、在超净工作台中取500uL裂解液RLT加入到1.5mL的离心管中，加入5uL β-巯基乙醇，60uL PLANTaid混匀备用；2、在95%乙醇擦过的桌面上用液氮研磨适量植物组织，取50mg 细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管中，立即剧烈震荡2-3min充分裂解，将裂解物13000rpm常温离心10min。
3、在新的离心管中加入新开封的无水乙醇250uL，按1:2的比例加入上清液500uL，用移液枪慢慢混匀，13000rpm常温离心60s。
4、每个吸附柱RA中加入750~800uL的上清液，静置后13000 rpm 常温离心1min，弃废液。
可以2管或3管合并到一个吸附柱RA 中。
5、向吸附柱RA中加入350~400uL的去蛋白液RWL，放置5min，12000 rpm常温离心30~60s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。
6、向吸附柱RA膜中央加入50uL DNase I工作液（DNase I 5uL，buffer5uL，无RNase 水40uL），37℃烘箱放置30min。
7、向吸附柱RA中加入350~400uL的去蛋白液RWL，放置5min，12000 rpm常温离心30~60s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。
该步骤可再重复一次。
8、加入漂洗液RW（请先检查是否已加入污水乙醇）500uL，静置后12000 rpm常温离心30s，弃掉废液；加入500uL漂洗液RW，重复一次。
9、将吸附柱RA放回空收集管中，12000 rpm常温离心30s，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。
10、取出吸附柱RA，放入一个新的RNase free离心管中，加入25uL 灭菌后的RNase free water（事先在80℃水浴中加热），室温放置2min，12000 rpm常温离心1min；将试管中的溶液吸出后再次加到吸附柱中，室温放置2min，12000 rpm常温离心1min。
植物总RNA提取步骤
植物RNA提取(FOREGENE试剂盒)使用前请现在Buffer PSL2和Buffer PRW2中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1、取500ul Buffer PSL1于2ml l离心管中，加入10ul β-巯基乙醇（需自备），混匀待用.2、取适量的新鲜植物叶片或组织，尽量剪碎，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨.3、迅速称取50mg研磨好的新鲜植物叶片粉末，转移至Buffer PSL1中，剧烈震荡混匀，室温静置5min.注意：组织量不要超过50mg，否则会导致RNA的质量下降。
在植物叶片粉末融化之前迅速转移，细胞破碎后，在无冷冻环境中，RNA极容易发生降解4、向上述液体中加入100ul Buffer PS，轻柔混匀.5、（可选步骤）如果发现组织裂解后的溶液中有比较明显的组织碎片或者溶液过于黏稠，12,000rpm （~13400xg）常温离心2-5min，取上清液进行下一步操作；如若没有此现象，可忽略.6、将所有上清液转移至DNA-Cleaning Column（DNA离心柱）放入收集管中，13,300rpm（~17000xg）离心2min.移除DNA-Cleaning Column（DNA离心柱）,保留收集管内的上清液.注意：植物组织裂解比较黏稠，在转移液体时可以将枪头尖端剪掉，便于取样，虽然大部分的细胞碎片被截留在DNA-Cleaning Column（DNA离心柱）膜上，但还是会有一些微量的细胞碎片通过DNA-Cleaning Column （DNA离心柱），在收集管底部以沉淀形式存在。
小心地将上清液移至干净的离心管中在进行步骤7，切勿将沉淀吸入上清液中.7、小心转移经过DNA-Cleaning Column离心过滤的上清液到2ml的RNase-Free离心管（需自备）中，向其中（体积应为600ul上清液）加入1.5倍（约900ul）体积Buffer PSL2(已加入无水乙醇）。
CTAB法提取RNA
CTAB法提取植物总RNA一、操作步骤：1.先在65o C水浴中预热适量的CTAB提取液（加入2% B—巯基乙醇）;2.液氮中迅速研磨新鲜的（或—70o C保存的）植物组织样品,充分研磨成均匀的粉末后取0.05-0。
1g置于1。
5mL离心管中（离心管中预先加入1mL CTAB 提取液), 迅速涡旋混匀30-60s, 然后65o C水浴4—5min；3.加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1）涡旋混匀,10000x g 离心15min沉淀蛋白质；4.将上清液转移至新的离心管，重复抽提一次，沉淀蛋白质;5.将上清液转移至新的离心管，加入等体积的4mol/L LiCl，4o C条件下沉淀2 h以上使RNA变性.6.4o C， 12000x g离心10min沉淀RNA，弃上清去除DNA，然后分别用500 uL 70％和100％的乙醇洗涤沉淀除去杂质;7.倒掉乙醇，瞬时离心，吸干离心管中的液体,超净工作台晾干沉淀,10 min。
Tips:缓缓倒掉乙醇，避免倒掉沉淀.尽量吸干残留液体，适当调整晾干沉淀的时间，确保乙醇完全挥发.晾干沉淀的时间不宜过长，否则不利于RNA的溶解.8.加入50 μL mixture(44 μL DEPC—H2O，5 μL 10 × DNaseⅠbuffer，1 μLDNaseⅠ）,37 °C孵育30 min。
Tips：配置mixture时应先加DEPC—H2O，再加buffer，最后加DNaseⅠ，配制好的mixture应充分混匀后再分装。
样品较多时，应计算好mixture的需求量,并适当增加配制量，因为分装mixture时会有损耗。
9.加入500 μL DEPC—H2O稀释RNA样品,加入200 μL氯仿/异戊醇（24/1）,缓慢摇匀10min。
Tips:需稀释RNA样品，以利于在氯仿/异戊醇抽提后转移上清液。
10.4 °C，12000 × g,离心10 min。
实验 一RNA提取及检测
RNA浓度检测过程
（1）取少量待测RNA样品，用DEPC 水稀释100倍。
（2）用DEPC 水做空白，在260 nm、280 nm、230 nm处调节 紫外分光光度计的读数至零。 （3）加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。 RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280 的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质 存在；比值太高，则提示RNA有降解。 OD260/OD230比值应≥ 2.0，若比值较低说明盐分过高。
(1) 研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。 加入Trizol（每100mg组织加1ml的Trizol），充分研磨， 放在室温下解冻。 (2) 除不溶性物质：2～8ºC下12000g离心10min，不溶性 物质沉淀，将RNA的上清移入1.5 ml离心管中。 (3)相分离：在15～30℃下放置5min，使核蛋白复合物完 全解离。加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，室温下温浴 2～3min。2～8℃下，≤12000g离心15min，RNA全部溶解 于上层水相中，把水相移入另一1.5ml离心管中。
RNA提取得率低 1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低： 不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等 是高丰度组织(总RNA含量2-4μ g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺， 胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μ g/mg)，膀胱， 骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μ g/mg)。 2. 组织起始量太少或者太多：
(4) 氯仿再次去杂：加0.5ml氯仿，剧烈振荡15sec，室
温下温浴2～3min；2～8℃下，≤12000g离心15min，把 水相转入1.5ml离心管中。 (5) RNA沉积：加入0.5ml异丙醇，15～30℃温浴10min； 2-8℃下，≤12000g离心10min，RNA沉积在离心管的底 部及侧壁。
提植物总RNA及去DNA和反转录标准方法(会给实验室一大笔提取试剂盒的经费)
Trizol法提取植物总的RNA及反转录可用于RT-PCR【中文版】一、植物总RNA 的提取抽提RNA 所用的研钵酒精灼烧5-10min或灭菌.，器皿均高温高压灭菌，以去除RNA 酶，所有试剂都保证没有RNA 酶污染。
1) 1.5ml 离心管,取0.1g 组织在液氮中研磨至粉末, 立即加入1ml Trizol，涡旋充分混匀后放置2min。
2) 加0.2体积（氯仿Chloroform），剧烈振荡15s（vortex），室温放置3min（或不放置，直接离心）。
3) 4℃，12000rpm 离心5min，样品会分成3 层，取上层水相，取上清。
4) 加等体积的异丙醇，混匀，4℃放置10min以上。
或可以-80℃过夜。
5) 4℃，12000rpm 离心20min，4℃弃上清，管底管侧形成胶状沉淀（可看到白色沉淀）。
6) 加1ml 75%乙醇，充分溶解沉淀。
4℃，12000rpm 离心5min。
倒掉上清，用移液器吸干。
7) 晾干约10 min。
(不要晾太长时间，看不到水就可以加灭菌水)8) 加50μl灭菌的超纯水，65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存。
（注：要是处理DNase就不能加这么多水。
可以加5μl）整个提取步骤最好咋在4℃或冰上完成二、DNase I 处理消化植物总RNA 中的基因组DNA1) 将上述全部提取的植物总RNA 5μl，然后顺序加入1μl 10×缓冲液，1μl DNase，3μl RNase-free水，总体积10μl，充分混匀后，37℃温育30 min。
2）加入300ul 灭菌水提高体积，然后加入300ul PCI，vortex；4℃，12000rpm 离心5min；3) 加入1/10 体积3M 醋酸钠(autoclaved) pH 5.2, 和2倍体积的100% EtOH；（-20℃，10-30min或可以-80℃过夜）4) 4℃，12000rpm 离心15min，6)75% EtOH, 300ul, 12000 rpm 5min7) dry （10-15min）and add 30-50 ul of ddH2O三、反转录cDNA1) 在上述总体积为11μl 反应液中加入1μl Oligo(dT)18 引物4μl 5×缓冲液，2 μl dNTP，1μl 反转录酶，1μl RNase 抑制剂，总体积20μl，充分混匀后，42℃温育1-1.5hr。
CTAB法提取植物DNA和RNA
1)取0.1~0.2 g幼叶片放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。
加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μlβ-巯基乙醇的2 ml离心管中，65℃水浴裂解40~60 min，每隔10min颠倒混匀一次。
然后常温12 000 r/min离心10 min。
2)取上清，加入2 ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀，4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。
重复这一步骤至界面清晰。
3)取上清，加入到1. 5 ml离心管, 加入两倍体积-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积3M的NaAc(pH=5.2), 小心颠倒均匀，-20℃沉淀10~30 min。
4)4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。
弃上清，用70%的乙醇洗2~3次。
室温干燥30 min。
5)加入1μl 10 mg/ml RNase，37℃温浴30-60 min去除RNA。
6)溶于40μl灭菌的ddH2O，琼脂糖凝胶检测。
注：无水乙醇、NaAc、70%的乙醇预冷7)取0.1~0.2 g植物材料放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。
加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μlβ-巯基乙醇的2 ml 离心管中，65℃水浴裂解40~60 min，每隔10min颠倒混匀一次。
8)加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀静置3 min，4℃, 12 000r/min, 离心10 min。
9)取上清800 μl于2 ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀冰上静置3 min，4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。
10)取上清600μl，加入1/30体积的NaAc（3M，pH=5.2）和1/10体积的无水乙醇（均预冷），混匀，在冰上静置10 min，再加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，4℃，12 000 r/min, 离心10 min。
CTAB法提取植物总RNA
CTAB法提取植物样本RNA一．实验原理CTAB是阳离子去污剂，低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，高离子（7MNaCl）强度溶液中沉淀蛋白、多聚糖。
破碎裂解细胞后，去除与RNA结合的蛋白质以及多糖，DNA等大分子，沉淀RNA,去除盐类及有机溶剂，溶解得到纯化的RNA。
二．实验试剂2% CTAB：CTAB 10g+NaCl 40.91g+1M Tris-HCl PH8.0 50ml+0.5M EDTAPH8.0 20ml，先用200ml水溶解，然后定容至500ml灭菌。
巯基乙醇, 氯仿：异戊醇=24:1，异丙醇，75%乙醇（-20℃预冷），RNaseFree ddH2O，DNaseI三．实验仪器及耗材移液器，水浴锅（或金属浴），振荡器，高速微量离心机，制冰机，2mL无RNA酶离心管，研钵，石英砂，液氮，吸水纸四．实验步骤1）2mL无RNA酶离心管中，加入980uL CTAB和20uL巯基乙醇，混匀65℃预热。
2）样品处理：样品取200mg（不超过），置于研钵中，加入少量石英砂，液氮研磨成粉，快速将粉末转移至上述液体1)中。
混匀，此时溶液为粘稠状。
3）65℃水浴10-30min，期间颠倒混匀几次。
4）加入等体积即1ml氯仿：异戊醇=24:1，混匀，12000rpm离心10min，取上清约900uL 至新离心管中5）重复4）2次6）加入等体积的异丙醇900uL，置于冰上10min或在冰箱中-20℃15min7）4℃离心20min 弃去上清，留沉淀8）75%乙醇（-20℃预冷）900ul漂洗1次，12000rpm离心5min8）移液枪吸去上清，离心管倒置在吸水纸上，干燥约20min9）用RNaseFree ddH2O 100uL溶解除去基因组DNA的步骤20uL体系：18ul RNA，1ul DNA酶，1ul buffer，0.25ul DNA酶抑制剂。
用PCR仪设置37℃30min，85℃5min。
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植物RNA提取步骤（附图）
实验步骤
1. 在eppendorf管中加入700ul 提取液（配方见后面）和10 ul巯基乙醇（在有褐化现象的时候再加就行，否则推荐不加），65度预热（可选）。
2. 研钵液氮预冷，取适量材料加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（有滑腻感），加入到预热的eppendorf管中水浴6min（可选）.取出后加入氯仿、酚各350ul，振荡20min。
3. 4℃13000rpm 离心15min，同时在另外的eppendorf管加入氯仿、酚各350ul。
4. 吸取上清，加入到上述离心管中，振荡10 min。
5. 4℃13000rpm 离心8min。
同时在另外的eppendorf管加入氯仿700ul。
6. 吸取上清，加入到上述离心管中，振荡10min。
7. 4℃13000rpm 离心8min。
同时在另外的eppendorf管加入350ul的75％乙醇、350ul的8MLiCl。
8. 吸取上清，加入到上述离心管中，－20℃沉淀30min，13000rpm离心20min。
9. 弃上清，75％乙醇清洗两次。
溶于30ul 的水（DEPC水），直接进行测定浓度和电泳，CTAB结果如下(左侧四个）：0.155ug/ul 260/280=2.11 260/230=2.20 SDS结果如下（右侧四个） 0.102ug/ul 260/280=1.78 260/230=2.05
电泳结果如下：
加入DNase和buffer（promega）,37度消化30min,氯仿抽提两次,用1/10体积NaAc 和二倍体积无水乙醇沉淀15min,13000rpm离心10min.75%酒精洗两次, 溶于30ul 的水（DEPC水）中.
提取液配方：
CTAB提取液：CTAB 2% m/v，四硼酸钠-硼酸缓冲体系0.0025mol/l（PH=8.0）NaCl 1.4mol/l
SDS提取液：SDS 2% m/v，四硼酸钠-硼酸缓冲体系0.0025mol/l（PH=8.0）NaCl 1.4mol/l
CTAB和SDS都不必说了，这里用四硼酸钠-硼酸缓冲体系的原因是Tris和DEPC起反应。
NaCl 的作用是提高盐浓度防止RNA降解。
如降解严重可选加EDTA二钠或减少水浴时间。
如提取杂质过多可选加PVP。
例如松树。
适用范围：各种常见树类如杨树等，草本类皆可。
以上的图片左侧四个泳道都为CTAB，右侧四个泳道为SDS。
提取杂志残留量：
CTAB水浴<CTAB未水浴<SDS水浴<SDS未水浴
而易降解程度正好相反，所以请酌情使用。