微生物试验
四、名词解释
1. 消毒（disinfection）：指杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。
2. 灭菌（sterilization）：杀灭物体上所有微生物的方法，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。
3. 无菌（asepsis）：指不存在活菌的意思。防止细菌进入人体或其他物品的操作技术，称为无菌操作。
4. 防腐（antisepsis）：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。使用同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时常为防腐剂。
5. 抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素，可在体内抑制细菌的繁殖，或在体外用于抑菌试验以检测细菌对抗生素的敏感性。
8. 抗链球菌溶血素O试验（antistreptolysin O test, ASO test）：是用已知的链球菌“O”溶血毒素抗原检测患者血清中是否有相应链球菌溶血素O抗体的中和试验。它常用于辅助诊断急性风湿热的风湿活动期。其效价大于1：400以上有参考意义。
9. 肥达试验（Widal test）：利用已知的伤寒沙门菌菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原以及甲型、乙型、丙型副伤寒沙门菌鞭毛（H）抗原分别与不同稀释度的患者血清做定量凝集试验。根据抗体的动态变化，用于辅助诊断伤寒和副伤寒。
10. 外斐试验(Weil-Felix test)：是指某些普通变形杆菌X19、X2和Xk菌株含有的菌体(O)抗原，可与斑疹伤寒立克次体和恙虫病立克次体的部分抗原发生交叉反应，故可用以代替立克次体作为抗原与患者的血清进行凝集反应，此称为外斐试验，用以辅助诊断有关的立克次体病。
11. 锡克试验（Schick test）：用少量毒素测定机体内有无抗毒素免疫的一种方法。在一侧皮内注射白喉毒素0.1ml，若无任何反应，表示机体对白喉有免疫力；若24h－48h注射部位开始出现红肿，直径1cm-2cm，表示机体对白喉易感，无免疫力，血液中无抗毒素中和毒素。
12. 结核菌素试验（tuberculin test）：属于迟发型超敏反应，用结核菌素试剂做皮肤试验测定机体是否感染过结核分枝杆菌的一种迟发型超敏反应性试验。感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗者，一般都出现阳性反应。
13. 鲍－金培养基（B－G培养基）：含甘油、马铃薯和血液的营养培养基，用百日咳杆菌分离培养。
14. 卫星现象：流感嗜血杆菌生长时需V因子和X因子，将其流感杆菌分区划线在巧克力平板或血平板上，然后点种金黄色葡萄球菌。因金黄色葡萄球菌能合成V因子，置于37℃，培养18h－24h后观察菌落特点，凡是靠近金黄色葡萄球菌的流感杆菌生长得较好，形成菌落较大；而远离金黄色葡萄球菌越远的流感杆菌菌落越小，此现象称为卫星现象。这有助于对流感嗜血杆菌的鉴定。
15. 二相性真菌（dimorphic fungus）：有些真菌可因环境条件的改变，而使两种形态发生互变，称为二相性。如球孢子菌、组织胞浆菌等在含有动物蛋白的培养基上37℃培养时，呈酵母菌型；在普通培养基上25℃培养时，呈丝状菌
18. CPE（cytopathic effect,CPE）：病毒在细胞内增殖造成细胞破坏死亡的作用称其为杀细胞效应，这种效应在体外组织培养时可观察到细胞变园、聚集、脱落等，称为致细胞病变作用（CPE）。主要见于无包膜病毒，如肠道病毒等。
20. 血清学诊断：用已知抗原检测病人的血清中是否有相应抗体以及抗体效价的动态变化血清学诊断可作为某些传染性疾病的辅助诊断。此试验一般取病人血清进行试验，故通常称之为血清学诊断。
五、问答题
1. 革兰氏染色法的方法、步骤、结果和意义是什么?
2. 答：革兰染色法的操作与步骤如下：
（1）标本片制作：取材涂片干燥固定
（2）染色步骤：
第一液碱性结晶紫，初染1min，水洗；
第二液碘液，媒染1min，水洗；
第三液 95%乙醇，脱色，30s，水洗；
第四液稀释石炭酸复红，复染30s，水洗。
（3）结果：光学显微镜放大1000倍，观察其形态、染色性，经革兰染色将细菌分为两大类，一类是革兰阳性菌呈紫色；一类是革兰阴性菌呈红色。
（4）革兰染色的意义：①鉴别细菌；②指导选择用药；革兰阳性菌对青霉素敏感；③致病性方面，革兰阳性菌大多数以其外毒素致病，革兰阴性菌以其内毒素致病。
3. 细菌生长繁殖需要哪些条件? 据细菌对氧气的需要不同分为哪四类?其特点和原因是什么?
答：细菌生长繁殖需要营养物质 pH值温度气体，据细菌对氧气的需要不同分为
（1）专性需氧菌：（obligate aerobe)
此类细菌具备完善的呼吸酶系统，需要分子氧作为受氢体以完成需氧呼吸，在无游离氧的环境下不能生长，如TB、霍乱弧菌。
（2）微需氧菌：(microaerophilic bacteria)
此类细菌在低氧压下生长最好，氧压增高对其有抑制作用，如空肠弯曲菌、红斑丹毒菌等。
（3）专性厌氧菌：（obligate anaerobe)
此类细菌缺乏完善的呼吸系统，只能在无氧的环境中进行发酵，在有游离氧存在时，不但不能利用分子氧，而且还将受其毒甚至死亡，如破伤风杆菌、脆弱类杆菌等。
（4）兼性厌氧菌：(facultative anaerobe)有需氧呼吸和发酵两种功能
4. 细菌的群体生长繁殖分哪几期？各期有何实际意义？
答：细菌的群体生长繁殖分为以下四期：（1）迟缓期。指细菌进入新的环境后短暂适应阶段。（2）对数生长期。保存菌，药敏试验。（3）稳定期。抗生素合成，芽胞形成，外毒素合成。（4）衰亡期。形态呈多形性。
5. 物理消毒灭菌法有哪些具体方法?
答：物理消毒灭菌法有干热灭菌法包括焚烧、烧灼、干烤、红外线；湿热灭菌法包括巴氏消毒法高压蒸气灭菌法间歇灭菌法煮沸法流动蒸汽消毒法；辐射杀菌法包括紫外线、电离辐射、微波；以及滤过除菌法、超声波消毒法、干燥与低温抑菌法。
6. 高压蒸气灭菌法的原理、及适用范围是什么
答：原理：一、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性，二、湿热穿透力强，三、蒸气变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。
条件：101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3℃，保持压力和温度（注意压力不要过大，以免发生意外），维持15～30 min。
适用范围：凡耐高温和潮湿的物品，如培养基、生理盐水、衣服、纱布、棉花、敷料、玻璃器材、传染性污物等都可应用本法灭菌。
7. 紫外线杀菌的原理、适用范围及使用注意事项是什么?
答：紫外线杀菌的机理主要是破坏细菌DNA构型，使单聚体胸腺嘧啶核苷酸变成双聚体胸腺嘧啶核苷酸，导致细菌死亡或突变。紫外线杀菌的最佳波长为265nm～266nm。使用紫外线应注意的事项：（1）紫外线的穿透力较弱，薄薄的一张纸即能阻挡透射，因此只适用于空气和物体表面的消毒。（2）紫外线对人体皮肤和角膜有一定的损伤作用，使用紫外线灯照射时应注意防护。
8. 简述影响化学消毒剂作用的因素。
答：影响化学消毒剂作用的因素有：（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间；（2）微生物的种类与数量；（3）温度；（4）酸碱度；（5）有机物。
10. 细菌感染的病原学检查方法有哪些?
答：（1）直接涂片镜检。凡是在形态和染色性具有特征的致病菌，直接涂片染色后镜检有助于初步诊断。（2）分离培养。所有标本均应作分离培养，以获得纯培养后进一步鉴定。（3）生化反应。不同的致病菌
具有不同的酶系统，其代谢产物不尽相同，借此可对一些致病菌进行鉴别。（4）血清学试验。采用含有已知特异性抗体的免疫学血清与分离培养除的未知纯种细菌进行血清学试验，可以确定致病菌的种和型。（5）动物试验。主要用于分离、鉴定致病菌，测定菌株产毒性。（6）药物敏感试验。药敏试验对知道临床选择用药，及时控制感染有重要意义。（7）分子生物学技术。近年来应用核酸杂交和PCR技术检测致病性微生物核酸时临床诊断学的重大发展。
11. 抗“O”试验的原理、方法、结果和意义是什么?
答：抗“O”试验的原理：
（1）抗链球菌溶血素“O”(AsO)—胶乳试剂的制备：将羧化聚苯乙烯乳胶与纯化溶血素“O”用碳化二亚胺交联，离心洗涤后用pH 7.6甲酸盐缓冲液配成l‰悬液，加0.1‰ NaN2防腐(即溶血素“O”免疫微球)。（2）被检测血清中的ASO与ASO胶乳试剂反应时，根据间接乳胶凝集试验的原理，可引起乳胶颗粒的聚集。若预先将被检测血清(含ASO)用25结合单位／毫升的溶血素“O”中和，然后再与ASO胶乳试剂反应，乳胶颗粒仍出现凝集者，说明被检测血清含ASO>250单位。
方法：
（1）病人血清用生理盐水稀释成1：50．56℃30分钟灭活补体。
（2）在反应玻片上分别滴加病人血清及阳性、阴性对照血清各l滴，再各滴加1滴标准溶血素“O”，轻轻摇动，使之混匀。
（3）于上述三个液滴上各加ASO胶乳试剂1滴，轻摇8分钟，观察各位置上有无聚集颗粒出现。
结果判断：
（1）有明显疑集者为阳性，无凝集者为阴性。
（2）病人血清1：50稀释阳性反应，相当于传统的溶血试验ASO 500单位，此时应将病人血清作l：80～1：100稀释，重复上述试验，若仍为阳性，则病人血清的ASO相应为≥800单位～≥1000单位。
意义：近期有链球菌感染。
13. 哪四种实验?大肠杆菌和产气杆菌IMViC试验的结果是什么?
IMViC试验代表：
吲哚试验（靛基质试验）
有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚无色，不能直接观察，加入吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛），与之作用生成玫瑰吲哚而呈红色。
甲基红（M.R）试验
有些细菌如大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，可继续分解丙酮酸产生乳酸、甲酸、乙酸等，由于产生大量有机酸，使培养基pH降至4.5以下，加入甲基红指示即显红色。而有些细菌如产气肠杆菌则分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质如醇、酮、醛等，则培养基的pH仍在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。
V-P（Voges-Proskauer）试验
某些细菌如产气肠杆菌具有丙酮酸脱羧酶，可使分解葡萄糖后产生的丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下，可被空气中的CO2氧化成二乙酰，二乙酰可与培养基中含胍基的物质起作用，生成红色化合物。
枸橼酸盐培养（Citrate）利用试验
枸橼酸盐培养基不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源、磷酸二氢铵为唯一氮源。当有的细菌（如产气肠杆菌）能利用铵盐作为唯一氮源，并能同时利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，便可在此培养基上生长，分解枸橼酸钠，使培养基变碱，培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
大肠杆菌和产气杆菌IMViC试验的结果是＋＋――，――＋＋
16. 试述肥达氏反应的原理、用途及结果判断注意事项
答：原理用已知伤寒沙门菌O、H抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌和希氏沙门菌H 抗原的诊断菌液与受检血清作定量凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验
用途及结果判断：患伤寒或副伤寒后，O与H在体内的消长情况不同IgM类O抗体出现较早，持续约半年，消退后不易受非伤寒沙门菌等病原体的非特异性刺激而重现。IgG类H抗体则出现较晚，持续时间长达数年，消失后易受非特异性病原刺激而能短暂的重复出现。因此，O、H凝集效价均超过正常值，则肠热症的可能性大；如果两者均低，患病可能性小；如O高H不高，则可能使感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌感染。
注意事项（1）首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断意义。
（2）曾接种过伤寒菌苗者，血清中含有凝集素。由于H凝集素在血内保持时间较久，O凝集素较短，所以曾注射菌苗者O凝集价在诊断上比较重要。
（3）真正的伤寒病人O凝集素出现常较H凝集素为早，存在于血清内时间较短；H凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。
（4）过去曾接种过伤寒菌苗或患过伤寒病，近期又感染流感或布鲁氏菌病时，可产生高效价的H凝集素及较低的O凝集素，此种反应称为非特异回忆反应，其他如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类似反应。
（5）确诊为伤寒的患者中，约有10％肥达氏反应始终为阴性，故阴性结果不能完全排除伤寒的诊断。（6）采血时间不同，肥达氏反应的阳性率也不同，发病第一周50％，第二周80％，第四周90％以上。恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。一般以双份血清(急性期和恢复期)对比，凝集价有明显上升者作为新近感染的指征。
18. 抗酸染色的原理、结果及意义是什么?
答：抗酸染色的方法是在取材、涂片、干燥、固定后，按以下步骤染色：
（1）初染。滴加石炭酸复红液于涂片上，染色10min或蒸染5min后，水洗。
（2）脱色。滴加3％盐酸酒精，脱色时频频抖动玻片，直至无明显颜色脱出为止，水洗。
（3）复染。滴加碱性美蓝液复染1min后，水洗。
结果：抗酸菌染成红色，细胞及其他细菌染成蓝色。
意义：鉴别分枝杆菌
19. 试述结核菌素试验的原理、结果分析及意义。
答：结核菌素试验是用结核菌素来测定对结核分枝杆菌能否引起皮肤迟发型超敏反应的一种试验，以判断机体对结核分枝杆菌有无免疫力。方法是分别取由人结核分枝杆菌来源和卡介苗来源的PPD各5单位注入两前臂皮内，48～72小时后，红肿硬结超过5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，对临床诊断有意义；两侧红肿中，若PPD-C侧大于BCG-PPD侧时为感染，反之则可能为卡介苗接种所致；小于5mm者为阴性反应。阳性反应表明机体已感染过结核分枝杆菌或卡介苗接种成功，对结核分枝杆菌有迟发型超敏反应及一定的特异性免疫力。强阳性反应则表明可能有活动性结核病。阴性反应表明受试者可能未感染结核分枝杆菌或未接种过卡介苗，但应考虑几种特殊情况：①受试者处于原发感染的早期，T淋巴细胞尚未被致敏；②老年人；③患严重结核病或其他传染病（如麻疹等）的患者；④获得性免疫功能低下，如艾滋病患者或使用免疫抑制剂治疗者，均可出现阴性反应。
22. 外斐氏反应的原理及用途是什么?
答：奇异变形杆菌的菌体O抗原与立克次体有共同抗原，故可用其代替立克次体作为抗原与相应患者血清进行交叉凝集反应，以辅助诊断立克次体病
23. 真菌的形态特点、生长方式是什么? 真菌的培养条件是什么?
答：形态特点与生长方式：单细胞真菌，以出芽方式繁殖。多细胞真菌，由孢子菌丝组成以形成孢子方式繁殖。培养条件：营养要求一般。常用沙保（Sabouraud）琼脂培养基培养（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、pH4.0～6.0），需一定的温度与湿度。浅部病原性真菌生长缓慢，1 ～2周形成典型菌落；深部病原性真菌生长较快，3 ～4天即可长出菌落。酵母型菌落、类酵母型菌落和丝状菌落。
25. 什么是血凝试验和血凝抑制试验?
答：有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。
29. 简述痰液标本的抗酸染色法
答：直接涂片法：
⑴收集患者清晨的咯痰，因患者经过一夜的蓄积后，痰中细菌的含量可能较多。
⑵用灭菌接种环取痰中干酪坏死的小块或带血的小块，在玻片上作薄而均匀的涂片。
⑶自然干燥，通过火焰固定后（同革兰氏染色法），用抗酸染色法染色。
抗酸染色法
（1）将已固定的标本滴加石炭酸复红盖满涂片面材料，维持3～5分钟，水洗。
（2）滴加盖胞脱氏溶液，轻轻晃动玻片，直至流出的酒精无红色为止（约1分钟），水洗，用吸水纸印干。油镜观察：
结核杆菌染成红色，细长、直的或微弯曲杆菌，偶尔有杆菌着色不均，呈颗粒状者。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成兰色。必须逐一观察各个视野，直到全部涂片找不到结核杆菌时，才可报告阴性。
30. 病毒感染的血清学诊断方法主要有哪些？
答：病毒感染的血清学诊断方法主要有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验，ELISA试验及蛋白印迹技术。
实验3-环境微生物的检测
实验三环境微生物的检测 一、实验目的 1.了解周围环境中微生物的分布情况。 2.懂得无菌操作在微生物实验中的重要性。 3.了解四大类微生物的菌落特征。 二、实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。土壤、江河湖海、尘埃、空气、各种物体的表面以及人和动物体的口腔、呼吸道、消化道等都存在着各种微生物。由于它们体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。但是只要稍加留意，我们就可以在发霉的面包、朽木上看到某些微生物群体。这些现象表明，自然界只要有微生物可以利用的物质和环境条件，微生物就可以在其上生长繁殖。据此，我们在实验室里就可以用培养基来培养微生物。 培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行灭菌。所谓灭菌是指采用各类的物理或化学因素，使物体内外的所有微生物丧失其生长繁殖能力的措施。经过灭菌后的物体是无菌的。消毒是与灭菌完全不同的概念，它是指用较温和的物理因素杀死物体表面和内部病原微生物的一种常用的卫生措施。 灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在1.05kg/cm2的蒸汽压力下，温度可达121℃。一般只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本操作技术。为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。
食品微生物检测实验室要求
自来水水池至少有两个，工作台，药品试剂柜，超净工作台（无菌室），灭菌锅，培养箱，冰箱，干燥箱，电子天平，显微镜，平皿，试管，三角瓶等玻璃器皿。这些都是必备基本设备，只要能摆放的下就可以。 一、微生物实验室设计 微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。 二、微生物实验室基本要求（一）准备室 准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。（二）洗涤室 洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。 （三）灭菌室 灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。（四）无菌室 无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，
由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。1. 无菌室的设置 无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点： （1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。 （2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。 2. 无菌室内设备和用具 （1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。 （2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可
食品微生物检测实验
实验一食品中细菌总数的检验 一、实验目的要求 1、了解细菌总数检验的意义。 2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法 3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能 4、熟练无菌操作技术。 二、原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌） 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个配制生理盐水 3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂 4、18×180mm试管3支稀释样品 5、1ml移液管 5 支 6、直径为90mm平皿10套倒营养平板 7、250ml量筒1支 8、玻璃珠：直径约5mm （二）应灭菌、消毒的器材 剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器
（三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶 2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶 四、实验内容 （一）、基本操作过程： 样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。 （二）、样品的稀释（样品的处理） 样品：袋装乳粉 外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀 1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。 3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。 4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。 5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。 注意： ①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。 ②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。 ③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。 ④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。
微生物实验3之革兰氏染色
华中科技大学微生物学实验报告 班级：生物制药1101班日期：2013 年 3 月16 日指导教师：邬建国实验组别：启明七组 姓名：何明组员姓名：张玉涛、王远馨 实验名称：革兰氏染色 一、实验目的 1.学习并掌握革兰氏染色的方法。 2.简单进行样品的革兰氏染色辨别样品中细菌类别 二、实验原理 1.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。 2为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。 3.革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样，染色与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。 4.阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。 三、实验材料 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；检测样品：含活菌酸奶 染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯四、实验方法
(一)涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min ）→水洗→路哥氏碘液媒染（1min ）→水洗→95%乙醇脱色（30s ）→水洗→番红复染（5min ）→水洗→干燥→镜检。 关键点：1.严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌； 而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌；2.菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。 （二)黑曲霉菌属于真菌,细胞较大,可用水片进行观察,,先在载玻片上滴一滴水,接种,盖上载玻片,即可拿到显微镜下观察. 五、实验结果与分析 1. 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数） 大肠杆菌放大倍数40x 金黄色葡萄球菌，放大倍数100x ，油浴 2.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片进行革兰氏染色（拍照， 注明放大倍数） 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混 合涂片，放大倍数100x,油浴
实验3-微生物接种技术
实验三微生物接种技术 一、实验目的 1、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。 2、掌握几种常用的微生物接种方法。 3、掌握微生物微生物扩大繁殖的基本方法。 4、认识微生物接种工具 二、实验原理 微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。 三、实验器材 主要仪器及设备无菌室、超净工作台、培养箱、振荡器、接种针、接种环、接种钩、接种铲，试管固体斜面培养基、培养基平板、三角瓶液体培养基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-琼脂平板、斜面培养基、牛肉膏-蛋白胨液体培养基、试管半固体培养基。 菌种大肠杆菌（Escherichia coli)、青霉(Penicillium sp．)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)放线菌等。 四、操作步骤 (一)斜面接种技术具体操作如下： 1、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。 2、点燃酒精灯。 3、接种用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序简述如下： ⑴手持试管将菌种和用于接种的斜面两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间。斜面向上，并使它们位于水平位置(图a)。 ⑵旋松棉塞先用右手将棉塞旋松，以便接种时易于拔出。 ⑶取接种环右手拿接种环在火焰将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。 ⑷拔棉塞用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图b、c所示。 ⑸环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。 ⑹取菌种待环冷却后轻轻沾取少量菌或孢子，然后将接种环移出接种管，如图d所示，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。 ⑺接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的
食品卫生微生物检验实验室操作要求
食品卫生微生物检验实验室操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条 件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员 安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 一、无菌操作要求 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精 棉球将手擦干净。 4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃 烧灼三次后使用。 5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min， 再经火焰烧灼。 8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求
1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备 进入无菌间后传递物品。 2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3.无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球 轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养 物等，必须经灭菌后方能使用。 (一)干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备 (1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包 装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 (2)装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2．装放 (1)干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
食品卫生微生物检验实验室操作技术
食品卫生微生物检验实验室操作技术要求??第一节实验室管理制度??一、实验室管理制度? 1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度,药品管理、使用制度,玻璃器皿管理,使用制度,并根据安全制度和环境条件的要求,本室工作人员应严格掌握,认真执行。??２．进入实验室必须穿工作服,进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 ?3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签,仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。? 4．各种器材应建立请领消耗记录,贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。??５．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗,实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。? 6.科、室负责人督促本制度严格执行,根据情况给于奖惩,出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。??二、仪器配备、管理使用制度? １．食品微生物实验室应具备下列仪器:培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱,电 2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求,保位pＨ计、高速离心机。?? 3.实验室仪器安证准确可靠,凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。?? 放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查,精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员,经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。 ?4．各种仪器（冰箱、温箱除外)，使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后,方可离去。 ?5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借,使用后按登记本的内容进行登记。 7．使用仪器时，应严格按?6．仪器设备应保持清洁,一般应有仪器套罩。?? 操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。 1.依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购?三、药品管理、使用制度?? 计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格,出厂日期等，领回后建立帐目,专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。 2.药品试剂陈列整齐,放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品 3．领用药品试剂，需填写请加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。?? 领单、由使用人和室负责人签字,任何人无权私自出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。 ? 4.称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好,必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。??四、玻璃器皿管理、使用制度 1.根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、
食品微生物检验技术
一、定义 通过一定的实验方法测定食品中的微生物，特别是致病微生物的数量、种类、性质，从而判断食品的卫生质量，保证消费者的身体健康。 二、食品微生物检验的内容 卫生指标菌检验 菌落总数测定 细菌检验 大肠菌群数测定 致病菌检验 霉菌、酵母菌数测定 真菌检验 产毒霉菌检验 霉菌毒素测定 三、食品微生物检验的特点 1、具有法规性 2、检验的范围广 3、杂菌含量多，要检验的菌少。 （1）需要增菌（2）抑制杂菌 4、检验结果具有数量界限 5、需要采样后尽快检验，快出结果 四、意义： 检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成经济损失。 五、食品卫生细菌常规检验项目 卫生指标菌 菌落总数测定 大肠菌群测定 沙门氏菌检验 u 致病菌 志贺氏菌检验 金黄色葡萄球菌检验 溶血性链球菌检验 六、细菌污染食品的途径 1、食品加工原料的污染 2、产、储、运、销过程中的细菌污染 3、从业人员的污染 4、食品加工过程中的污染 第一章 食品微生物检验中的生理生化实验 设计生化实验的原则：在实验中加入某些化学物质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入<的化学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。 一、过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理 1、2H 2O 2 过氧化氢酶 2H 2O+O 2 阳性 2、过氧化物酶： RH 2+H 2O 2 过氧化物酶 R+2H 2O 阳性：细菌变为黑褐色； 阴性： 不变色。 阳性 阴性 二、细胞色素氧化酶实验原理 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。 三、氰化钾实验 阳性： 不抑菌，变混浊 阴性：抑菌 无 蓝 四、硝酸盐还原实验原理 KNO 3 还原酶 KNO 2KNO 2 +对氨基苯磺酸+ a -萘胺 红色化合物（立刻或数分钟内）红色 无色 五、糖发酵实验 分解糖产酸，PH 值下降，使 培养基的 酸碱指示剂发生变化。 阳性：产酸产气 六、氧化发酵实验（O/F 实验 有些微生物分解葡萄糖 必须有氧参加，此种细菌菌称为氧化型； 阳 阴 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。 灭菌琼脂（厌氧） 七、甲基红实验（MR 实验）和V-P 实验 1、MR 实验原理：一些细菌分解葡萄糖产 生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH 值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应 2、V-P 实验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（实验结果同MR 实验） 阴 八 、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验） 一些微生物可以以铵盐作为唯一 的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳 源，在柠檬酸盐培养基上生长，分 解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基 变成碱性，酸碱指示剂变色 九、丙二酸钠实验 一些微生物可以以丙二酸钠 作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 十、马尿酸盐实验 一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。 十一、明胶液化实验 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。 十二、苯丙氨酸脱氨酶实验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶， 可以脱氨 生成苯丙酮酸， 其与FeCl 3反应产生绿色 。 十三、氨基酸脱羧酶实验 一些细菌可以产生氨基酸 脱羧酶使氨基酸脱酸，产生胺类物质，使培养基
微生物学实验报告
微生物学实验报告（格式标准） (生命科学专业) 教师：黎勇
目录索引 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测和分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科 实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的
运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1. N·A=n·sinα 2. D=λ/ 3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的. 菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图 取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 （三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制）
空气食品接触面微生物检验方法检验标准
空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准 1、目的： 检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标，生产区域环境当中病原微生物的监控，达到规定标准，以控制食品成品的质量。 2、参照标准： 中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979－1995、《HACCP原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》GB/T 18204.1－2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。 3、采样与检测方法： 3.1空气的采样与测试方法 3.1.1样品采集： (1)取样频率： a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行采样，以便了解车间卫生清扫消毒情况。 b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行采样。 c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点，整改后再进行采样检验。 d)实验性新产品，按客户规定频率采样检验。 e)正常生产状态的采样，每周一次。 （2）采样方法 在动态下进行，室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1 m；室内面积超过30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直
径9 cm)置采样点(约桌面高度)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于0～4℃条件时，送检时间不得超过24h。 3.1.2菌落培养： （1）在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。 （2）将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。 （3）菌落计算： a) 记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或 在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不可遗漏。 b) 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个 以上菌落计数。 3.2工作台（机械器具）表面与工人手表面采样与测试方法： 3.2.1样品采集： (1)取样频率： a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车 间卫生清扫消毒情况。 b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。 c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验 不合格点，整改后再进行擦拭检验。 d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。 e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。 f)正常生产状态的擦拭，每周一次。 （2）采样方法： a) 工作台（机械器具）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取 与食品直接接触或有一定影响的表面）取25cm2的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的
实验三微生物生长曲线的测定
实验三微生物生长曲线的测定 一、实验目的目的 1、了解细菌生长曲线特点及测定原理 2、学习用比浊法测定细菌的生长曲线 二、实验原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、实验材料 1、菌种 2、培养基：肉膏蛋白胨培养基 3、仪器和器具 721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。 4、流程 种子液→标记→接种→培养→测定 四、实验步骤
1、种子液制备 取细菌菌种1支，以无菌操作挑取1环菌液，接入肉膏蛋白胨培养液中，培养18h 作种子培养液。 2、标记编号 取盛有30mL无菌肉膏蛋白胨培养液的三角瓶6个，分别编号为0、4、8、12、16、20。 3、接种培养 用2mL无菌吸管分别准确吸取1mL种子液加入已编号的6个三角瓶中，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将三角瓶取出测定OD值。 4、生长量测定 将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在.～以内，经稀释后测得的O D值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。 五、实验结果与分析 以上述表格中的时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制细菌的生长曲线。
食品微生物学检验 系列知识点汇总
食品微生物学检验GB 4789 系列知识点汇总 GB 4789.1-2016 食品卫生学检验总则 一、2016版总则变更内容 1.删除了标准中的英文名称、起草单位变更为中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局。 2.删除了规范性引用文件。 3.修改了实验室基本要求： 微生物专业教育或培训经历（如生物学、植 物学、医学、食品科学与工程、食品质量与安全等与微 生物有关的相关专业），具备相应的资质（应有岗位上岗 证、生物安全上岗证和压力容器上岗证），能够理解并正 确实施检验。 ①人员修改为检验人员实验室生物安全操作和消毒知识（相关标准及培训， 如GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求、消毒技术 规范（2002））。 品。 确保自身安全。
有颜色视觉障碍的人员不能从事涉及辨色的实验（即无颜 色视觉障碍）。 ②环境与设施--突出温度、湿度和洁净度。 生物危害程度应与实验室生物防护水平相适应: 灭的微生物，如天花病毒。 间传播如霍乱弧菌。 病原微生物分类 沙门氏菌、单增李斯特氏菌。 第四类：通常不会引起人或动物疾病的微生物。 BSL-1）：操作第四类病原微生物（属于正压，适用 ） 实验室生物安全级别BSL-2）：操作第三类病原微生物（属于负压，适用 II级生物安全 ） BSL-3）：操作第二类病原微生物
四级（BSL-4）：操作第一类病原微生物 消毒：是杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其中的孢子。 灭菌：是杀死和去除所有微生物及其中孢子的过程。 蒸法消毒） 消毒剂表面消毒 微生物实验 高压灭菌 干热灭菌（180℃1h或170℃2h） 培养基和试剂灭菌 过滤除菌 紫外线消毒法：紫外灯管放射一定波长，破坏细菌或病毒的DNA和RNA，使他们丧失生存能力和繁殖能力，从而达到灭菌目的。紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌芽孢对其抵抗力大，且紫外线穿透力极低，所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。
实验室认可准则在微生物检验领域的应用说明CL09
实验室认可准则在微生物检验领域的应用说明（CL09） 编制说明 一、任务来源 本修订任务是中国合格评定国家认可委员会2012年度工作计划内容，也是中国合格评定国家认可委员会专业技术委员会食品分委员会2010~2012年的主要工作内容。由CNAS 秘书处负责进行修订。 二、意义 实验室认可准则在微生物检验领域的应用说明（CNAS-CL09:2006）经过多年的使用，对于规范微生物检验领域认可起到非常重要的作用，该“应用说明”也几经修订，日臻完善；但近年来国内外食品安全事件频发，尤其是致病微生物引起的食品中毒问题非常严重，国内对实验室生物安全要求的在不断提高、大规模微生物检测项目实验室间比对暴露出培养基问题的呈现，原“应用说明”中对人员的专业背景要求过低等因素，导致问题越来越突出，对认可准则在微生物检测领域的应用说明进行修订的任务迫在眉睫；认可委在广泛征求意见上，多次组织来自卫生部疾控中心、质检总局、大专院校、企业等各个领域的专家，包括国家标准审评委员会委员、食品安全国家标准制修订者、微生物行业标准制修订者、生物安全国家标准制修订者等在充分讨论基础上，对该应用说明进行了修订，确保修订后的应用说明符合中国现状，且保证微生物检验的准确。 三、修订的主要依据 1.中华人民共和国食品安全法 2.GB 19489-2008实验室生物安全通用要求 3.食品检验机构资质认定评审准则 4.GB 4789.1-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验总则 5.病原微生物实验室安全管理条例国务院令第424号 6.APLAC T007 食品检验实验室指南（第三版）（2010.9）
7.NATA 生物测试领域ISO/IEC17025认可补充要求（2011.11） 8.HOKLAS SC-08微生物检测领域（HOKLAS补充准则第8号第六版） （2011.11）。 9.EURACHEM/EA-04/10微生物实验室认可（2002.7）。 10.SAC-SINGLAS技术注解C&B 001 化学与微生物检验实验室特殊要求 （2009.12）。 11.SAC-SINGLAS 技术注解C&B 002 化学与生物检验实验室常用设备的质量保证 （2010.2） 12.ISO16140:2003 食品和动物饲料微生物检测方法确认指南 13.GB/T 27405-2008《实验室质量控制规范食品微生物检测》。 14.TSG R0003-2007简单压力容器安全技术监察规程 15.GB 50346-2011 生物安全实验室建筑技术规范 16.GB 50073-2001 洁净厂房设计规范 四、修订内容 主要的修改内容汇总如下： 1.原“应用说明”对使用范围没有规定；增加了“主要适用于食品化妆品、环境测 试、玩具、医药卫生、纺织品等微生物检测”。 2.针对生物安全方面，增加了生物安全监督员和生物安全责任人的要求；增加了处 于安全考虑的文件和记录的控制要求；增加了对实验室生物安全等级的要求。 3.针对培养基的质量控制和验收，将培养基按类别进行了分类，明确区分了质量控 制和技术验收的区别，明确了技术性验收的指导原则。 4.针对人员，增加了专业背景的要求，即授权签字人应具有相关专业本科以上学历， 并具有三年以上相关技术工作经历。如果不具备上述条件，应具有足够的微生物 相关领域检测工作经历，至少十年。 5.明确实验室常用的灭菌设备高压蒸汽灭菌锅的对人员资质的要求。 6.明确了菌种传代的要求。 7.增加了微生物领域测量不确定度的要求。 8.增加了质量控制应包括的领域和项目。
食品微生物综合实训-酸奶生产中微生物检验与控制
酸奶生产系统中微生物检验点及评价标准 （以酸奶生产为例） 3.1产品生产工艺描述 酸奶是以新鲜的牛奶为原料经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。按照是否加糖，酸奶可分为淡酸奶和加糖酸奶两种，我国常见的酸奶制品是加糖酸奶，即在制作酸奶的原料乳中加入一定量的白糖进行发酵得到的酸奶产品。 酸奶营养丰富，其蛋白质和钙质较鲜乳更易消化吸收，抑制腐败细菌的繁殖，降低肠道内毒素浓度。酸奶内含乳酸菌并在发酵过程中产生乳酸及族维生素等,能增强消化，促进肠道蠕动和机体物质的代谢，提高人的免疫力, 长期饮用即可保证钙质的需求, 又可健肠胃, 是一种对人体肠胃非常有益的保健食品。 3.1.1 酸奶的生产工艺 1）凝固型酸奶生产工艺流程 原料奶验收→标准化→均质→杀菌→冷却→接种→搅拌→灌装封口→发酵→冷却→后熟→凝固型酸乳 2）搅拌型酸奶生产工艺流程 原料奶验收→标准化→均质→杀菌→冷却→发酵→搅拌→灌装封口→冷藏后熟→搅拌型酸乳 ↑ 果料、香精 前者先冷却，分装后培养发酵。后者先冷却接种，发酵后分装。 凝固型酸乳用于纯酸奶的生产，搅拌型酸乳还可用于果味、果料等花色品种酸奶的生产。一般凝固型纯酸奶要有良好的组织状态，要防止有裂纹出现，因此要先搅拌分装再发酵。带有果料的酸奶影响乳酸菌的发酵，不能保持良好的组织状态，故采用先发酵后搅拌加果料的方式。 3.1.2 操作要点 1）原辅料验收 （1）原料乳验收 原料奶必须符合GB19301 — 2010《食品安全标准生乳》规定的各项要求，严格进行感官、理化、微生物等指标的检验，验收原料奶单位必须具备《生鲜乳收购许可证》，每批原料验收包括：感官、酒精、密度、脂肪、蛋白质、冰点、非脂乳固体、抗生素以及掺假检测。定期监测致病菌、重金属、黄曲霉等指标。
食品微生物指标检测实验方案
微生物学实验方案 题目：食品中微生物指标检测班级：12级食品科学 小组成员：代来鑫郑君花张建敏指导老师：陈莉老师 时间：2012年10月
1 意义 食品微生物指标是指某个或某批食品中微生物的存在与否（定性分析） 或每个质量、体积、单位面积或每批产品中微生物存在的数目及其毒素（或代 谢产物）的限制（定量分析），用以评价食品的微生物学卫生状况及其安全性。 在我国食品卫生标准中，通常微生物指标包括菌落总数、大肠菌群、致 病菌等的检测，其中菌落总数和大肠菌群是必检项目，致病菌不得检出。 食品中微生物菌落总数指食品检样经过处理，在一定的条件下培养后， 所得1mL或1g检样中所含菌落的总数，主要作为食品被污染程度的标志，常用倾注平板菌落计数法。大肠菌群是指一群在37℃，24h能发酵乳糖产酸、产气，需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌，它反映了食品是否被粪便污染，同时 也间接地指出食品是否有被肠道致病菌污染的可能性，常用的检测方法是最大 可能计数法。 2 目的与要求 2.1 了解菌落总数、大肠菌群测定在食品卫生评价当中的意义 2.2学习并掌握细菌分离和活菌计数的基本方法和原理 2.3学习并掌握大肠菌群的检验方法 3 实验器材 3.1食品检样 3.2培养基 平板计数琼脂培养基：将胰蛋白胨 5.0 g、酵母浸膏 2.5 g、葡萄糖 1.0 g、琼脂 15.0 g、蒸馏水 1000 mL、pH 7.0±0.2加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：将胰蛋 白胨或胰酪胨 20.0 g、氯化钠 5.0 g、乳糖 5.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g、磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g、月桂基硫酸钠 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL溶解于蒸馏水中，调节 pH 为pH 6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压，灭菌15 min。 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：将蛋白胨10.0 g、乳糖10.0 g溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～ 7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH为7.2±0.1，再加入0.1%煌绿水溶 液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管 的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。
食品微生物学检验GB 4789 系列知识点汇总
食品微生物学检验GB 4789 系列知识点汇总GB 4789.1-2016 食品卫生学检验总则 一、2016版总则变更内容 1.删除了标准中的英文名称、起草单位变更为中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局。 2.删除了规范性引用文件。 3.修改了实验室基本要求： 应具有相应的微生物专业教育或培训经历 （如生物学、植物学、医学、食品科学与工 程、食品质量与安全等与微生物有关的相关 专业），具备相应的资质（应有岗位上岗证、 生物安全上岗证和压力容器上岗证），能够 理解并正确实施检验。 实验室生物安全操作和消毒知识（相 关标准及培训，如GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求、消毒技术规范（2002））。 应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止 人为污染样品。 应在检验过程中遵守相关安全措施的规定， 确保自身安全。 有颜色视觉障碍的人员不能从事涉及辨色 的实验（即无颜色视觉障碍）。
②环境与设施--突出温度、湿度和洁净度。 生物危害程度应与实验室生物防护水平相适应: 引起人和动物非常严重疾病，国家未发 现或已宣布消灭的微生物，如天花病毒。 引起任何动物比较严重疾病，在人和人、 人和动物之间传播如霍乱弧菌。 病原微生物分类 成严重危害如沙门氏菌、单增李斯特氏 菌。 BSL-1）：操作第四类病原微生物（属 适用范围如大肠埃希氏菌、枯草芽 重要设备是超净工作台，它可以 ） 实验室生物安全级别BSL-2）：操作第三类病原微生物（属 II级生物安全柜。） BSL-3）：操作第二类病原微生物 BSL-4）：操作第一类病原微生物 消毒：是杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其中的孢子。
微生物检验记录1
编号：RSB26-02 药品微生物限度检查实验记录 ml ①匀浆仪挡min ②研钵法③保温振摇法④薄膜过滤法 2、水溶性供试品：取供试品g或ml 加入乳化剂（g或ml） 3、抑菌性供试品处理方法：取供试品g或ml 加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液ml 方法：①培养基稀释法②离心沉淀法③薄膜过滤法④中和法细菌数：30~35℃48h 霉菌（酵母菌）总数：23~28℃72h 大肠埃希菌检查35~37℃24h 沙门菌检查 活螨检查 检验员：复核员：
微生物限度检查操作记录 复核人：检验人：
编号：RSB26-02 药品微生物限度检查实验记录 ①匀浆仪挡min ②研钵法③保温振摇法④薄膜过滤法 2、水溶性供试品：取供试品g或ml 加入乳化剂（g或ml） 3、抑菌性供试品处理方法：取供试品g或ml 加入0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液ml 方法：①培养基稀释法②离心沉淀法③薄膜过滤法④中和法细菌数：30~35℃48h 霉菌（酵母菌）总数：23~28℃72h 大肠杆菌检查35~37℃24h 沙门菌检查 活螨检查 供试品瓶或盒直接检查法集螨法 结果
编号：RSB27-01 无菌检查记录表 检品编号: 室温: 湿度: 供试液制备：1、常规法供试品瓶（支）无菌0.9%氯钠溶液ml 2、非水溶液性供试品供试品瓶（支）加入乳化剂（g或ml）检查法：1、直接法 2、薄膜法药液浓度冲洗液用量ml 结论：本品按中国药典2005版二部XL.H无菌检查法，结果规定 复核者：检验者：
编号：RSB26-03 药品微生物限度检查实验记录 供试液制备：1、常规法：取供试品g或ml 加入0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至ml ①匀浆仪挡min ②研钵法③保温振摇法④薄膜过滤法 2、水溶性供试品：取供试品g或ml 加入乳化剂（g或ml） 3、抑菌性供试品处理方法：取供试品g或ml 加入0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至ml 方法：①培养基稀释法②离心沉淀法③薄膜过滤法④中和法 细菌数：30~35℃48h 霉菌（酵母菌）总数：23~28℃72h 大肠杆菌检查35~37℃24h 沙门菌检查 活螨检查 供试品瓶或盒直接检查法集螨法 结果 检验员：复核员：