蛴螬多糖组分HDPS2Ⅱ的理化性质及对肝癌的抑制作用

h t t p ://X B Y Z ．c b pt ．c n k i ．n e t 长期灌胃高脂乳剂能形成高脂血症,尽管该方法在保证个体间高脂乳剂摄入量的统一方面弥补了饲喂法造成的模型动物之间指标的均一性较差的不足,但此方法使动物处于长期应激状态,影响结果的准确性[２].因此采用高脂饲料喂饲法让动物自由摄食更接近人类患高脂血症的过程,取得的结果也更准确.实验结果显示,利用近交系的C ５７B L /６小鼠个体间差异很小,且造成小鼠高胆固醇血症后恢复正常饮食１周,高胆固醇血症虽有降低,但与正常组比较依然偏高.同时,低三酰甘油血症有所恢复,说明实验中所采用的高脂饮食对小鼠血浆中三酰甘油有抑制作用.实验结果表明,使用高糖为主的饲料喂饲C ５７B L /６小鼠４周并不能造成小鼠内源性高三酰甘油血症,与高脂饲料１相同,极大地抑制了血浆中三酰甘油的水平(５５０ʃ３７m g L －１vs１０８９ʃ４９m gL －１,P ＜０．０１);同时,该配方高脂饲料升高血浆胆固醇的幅度也不大(约１．６倍),因此以高糖为主的高脂饲料并不适合造成小鼠高脂血症模型.这与加糖的脂肪乳长期灌胃也不能形成高三酰甘油血症的结果一致[１４].研究表明,采用含有一定比例猪油的高脂饲料长期喂饲能够成功建立小鼠高胆固醇血症模型,但不能建立高三酰甘油血症模型,如想同时建立小鼠高胆固醇血症和脂肪肝模型,高脂饲料中添加胆固醇和胆酸钠是必须的.因此,要筛选主要降低胆固醇的天然产物可选择小鼠高胆固醇血症模型.研究表明,用以猪油或高糖为主要配方的高脂饮食无法成功诱导昆明种小鼠或C ５７B L /６小鼠成为高三酰甘油血症模型.参考文献:[１]㊀Z h a o J J ,Z h uH ,W a n g S J ,e t a l ．N a o x i n t o n gpr o t e c t s a Ｇg a i n s t a t h e r o s c l e r o s i s t h r o u g h l i p i d Ｇl o w e r i n g an d i n h i b i Ｇt i n g m a t u r a t i o n o f d e n d r i t i c c e l l s i nL D L r e c e pt o r k n o c k Ｇo u tm i c e f e dah i gh Ｇf a td i e t [J ]．C u r rP h a r m D e s ,２０１３,１９(３３):５８９１Ｇ５８９６．[２]㊀朱竟赫,赵金明,秦文艳,等．高脂血症实验动物模型研究概述[J ]．实验动物科学,２０１２,２９(２):４８Ｇ５２．[３]㊀高敏,倪凯,杨玉琪．高脂血症动物模型的研究概况[J ]．云南中医中药杂志,２０１０,３１(１０):７９Ｇ８１．[４]㊀英提扎尔 艾孜木江,阿依姑丽 艾合麦提,李珊,等．野山杏果肉中总有机酸对高脂血症大鼠体内抗氧化作用研究[J ]．西北药学杂志,２０１８,３３(３):３５９Ｇ３６３．[５]㊀周淑芳,李晶,关溯,等．四氢普伐他汀钠对高血脂模型新西兰兔脂质代谢的影响[J ]．西北药学杂志,２０１６,３１(１):５１Ｇ５６．[６]㊀K r i s ＧE t h e r t o nP M ,D i e t s c h y J ．D e s i g nc r i t e r i a f o r s t u d Ｇi e s e x a m i n i n g i n d i v i d u a l f a t t y ac i de f f e c t so nc a rd i o v a s Ｇc u l a r d i se a s e r i s kf a c t o r s :h u m a na n da n i m a l s t u d i e s [J ]．A mJC l i nN u t r ,１９９７,６５(５S u p p l ):１５９０S Ｇ１５９６S ．[７]㊀M a r o t t i KR ,C a s t l eCK ,B o y l eTP ,e t a l ．S e v e r e a t h e r o Ｇs c l e r o s i s i n t r a n sg e n i cm i c e e x p r e s s i n g s i m i a nch o l e s t e r y l e s t e r t r a n s f e r p r o t ei n [J ]．N a t u r e ,１９９３,３６４(６４３２):７３Ｇ７５．[８]㊀杨健,周群．高脂血症模型的研究概况[J ]．湖南中医杂志,２０１３,２９(４):１３２Ｇ１３３．[９]㊀M o g h a d a s i a n M H ,F r o h l i c hJJ ,M c M a n u sB M．A d Ｇv a n c e s i ne x p e r i m e n t a ld y s l i pi d e m i aa n da t h e r o s c l e r o s i s [J ]．L a b I n v e s t ,２００１,８１(９):１１７３Ｇ１１８３．[１０]梁红峰,陈方．高脂血症模型小鼠生化指标的变化[J ]．广东微量元素科学,２００４,１１(４):４２Ｇ４５．[１１]吕建敏,应华忠,徐孝平,等．高脂血症动物模型研究进展[J ]．浙江中医学院学报,２００５,２９(４):８７Ｇ８９．[１２]侯杰军,闫曙光,付强,等．大鼠高脂血症模型不同配方的实验研究[J ]．陕西中医学院学报,２００９,３２(１):４８Ｇ４９．[１３]张智,闪增郁,向丽华,等．大鼠实验性高脂血症两种造模方法的比较[J ]．中国中医基础医学杂志,２００４,１０(２):３３Ｇ３４,２４．[１４]张少芬,陈方,吴铁,等．长期脂肪乳剂灌胃致小鼠高脂血症模型的研究[J ]．广东医学院学报,２００４,２２(４):３２８Ｇ３３０．(收稿日期:２０１８Ｇ０７Ｇ１０)基金项目:国家自然科学基金项目(编号:８１４７３３２９);杨凌示范区产学研用协同创新重大项目(编号:２０１７C X Y Ｇ１９)作者简介:郝晓伟,女,硕士研究生∗通信作者:曹蔚,女,教授,博士生导师蛴螬多糖组分H D P S Ｇ２Ⅱ的理化性质及对肝癌的抑制作用郝晓伟１,２,靖㊀会１,２,李㊀萍２,张㊀甜３,周四元１,２,李小强１,２,曹㊀蔚１,２,３∗(１．国家中医药管理局中药胃肠药理重点研究室,西安㊀７１００３２;２．空军军医大学药学系,西安㊀７１００３２;３．西北农林科技大学化学与药学院,陕西省天然产物化学生物学重点实验室,杨凌㊀７１２１００)摘要:目的㊀探讨蛴螬均一性多糖组分H D P S Ｇ２Ⅱ对肝癌的抑制作用.方法㊀采用碱水提取,反复冻融除蛋白等方法获得蛴螬总多糖;用离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法分离纯化总多糖获得均一性多糖组分H D P S Ｇ２Ⅱ.用高效尺寸排阻色谱法(H P S E C )和考马斯亮蓝法等测定H D P S Ｇ２Ⅱ的理化性质.采用M T T ㊁划痕实验和H ２２肝癌移植瘤小鼠模型测定蛴螬多糖体内１５西北药学杂志㊀２０１９年１月㊀第３４卷㊀第１期外的抗肿瘤活性.结果㊀蛴螬多糖组分H D P SＧ２Ⅱ的相对分子质量为８．２ˑ１０３D a,蛋白质㊁糖醛酸㊁硫酸基和氨基含量分别为２ ０８％,１２．０８％,０．２４％和４．８９％.H D P SＧ２Ⅱ体外可抑制肿瘤细胞的迁移,体内可显著抑制小鼠体内肿瘤的生长,H D P SＧ２Ⅱ中㊁高剂量组抑瘤率分别为５２．０％和５６．９％;与环磷酰胺(C T X)组比较,蛴螬多糖组分H D P SＧ２Ⅱ可显著增高脾脏指数㊁白细胞和淋巴细胞数量(P＜０．０５).结论㊀蛴螬多糖组分H D P SＧ２Ⅱ具有抑制细胞体外迁移㊁小鼠移植瘤的生长和免疫调节作用,具有进一步研发的价值.关键词:蛴螬;多糖;H D P SＧ２Ⅱ;抗肿瘤;肝癌D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００４Ｇ２４０７．２０１９．０１．０１３中图分类号:R９６５㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:１００４Ｇ２４０７(２０１９)０１Ｇ００５１Ｇ０６P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t y o f p o l y s a c c h a r i d eH D P SＧ２Ⅱf r o m H o l o t r i c h i a d i o m p h aＧl i a B a t e s a n d i t s a n t i t u m o r e f f e c t s o nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m aHA O X i a o w e i１,２,J I N G H u i１,２,L IP i n g２,Z HA N G T i a n３,Z H O U S i y u a n１,２,L IX i a o q i a n g１,２,C A O W e i１,２,３∗(１．K e y L a b o r a t o r y o f G a s t r o i n t e s t i n a l P h a r m a c o l o g y o fC h i n e s e M a t e r i a M e d i c ao ft h eS t a t e A d m i n i s t r a t i o no fT r a d i t i o n a lC h i n e s e M e d i c i n e,X iᶄa n ７１００３２,C h i n a;２．S c h o o l o f P h a r m a c y,t h eA i r F o r c eM e d i c a lU n i v e r s i t y,X iᶄa n７１００３２,C h i n a;３．S h a a n x i K e y L a b o r a t o r y o fN a t uＧr a l P r o d u c t s&C h e m i c a l B i o l o g y,S c h o o l o fC h e m i s t r y&P h a r m a c y,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,Y a n g l i n g７１２１００,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T od e t e r m i n e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m ao f p o l y s a c c h a r i d eH D P SＧ２Ⅱf r o m H o l o t r i c h i a d i o m p h a l i aB a t e s．M e t h o d s T o t a l p o l y s a c c h a r i d e s f r o m H o l o t r i c h i a d i o m p h a l i a B a t e sw e r e o b t a i n e d b y a l k a l i w a t e r e x t r a c t i o n,r eＧp e a t e d f r e e z i n g a n d t h a w i n g m e t h o d,e t c．P o l y s a c c h a r i d eH D P SＧ２Ⅱw a s o b t a i n e db y i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a n ds i z e e x c l uＧs i o n c h r o m a t o g r a p h y．T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o fH D P SＧ２Ⅱw e r ed e t e r m i n e db y h i g hＧp e r f o r m a n c e s i z eＧe x c l u s i o nc h r o m aＧt o g r a p h y(H P S E C)a n d c o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u em e t h o d,e t c．M T T,w o u n d s c r a t c h a s s a y a n dH２２m i c em o d e l s o f l i v e r c a n c e rw e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e a n t i t u m o r a c t i v i t y o f p o l y s a c c h a r i d eH D P SＧ２Ⅱi n v i v o a n d i n v i t r o．R e s u l t s T h em o l e c u l a rw e i g h t o fH D P SＧ２Ⅱw a s８．２ˑ１０３D a,a n d t h e c o n t e n t s o f p r o t e i n,u r o n i c a c i d,s u l f a t e a n d a m i n o g r o u p w e r e２．０８％,１２．０８％,０．２４％a n d４．８９％, r e s p e c t i v e l y．H D P SＧ２Ⅱi n h i b i t e d c e l lm i g r a t i o n i n v i t r o a n d i n h i b i t e d t h e g r o w t ho f t u m o r i nm i c e a n d t h e a n t iＧt u m o r r a t e s o f t h e h i g ha n dm e d i u mＧd o s e H D P SＧ２Ⅱa d m i n i s t e r e d g r o u p w e r e５２．０％a n d５６．９％,r e s p e c t i v e l y．C o m p a r e d w i t hc y c l o p h o s p h a m i d e g r o u p,t h e p o l y s a c c h a r i d eHD P SＧ２Ⅱw a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d t h e i n d e xo f s p l e e n,W B Ca n d l y m p h o c y t e(P＜０．０５)．C o n c l u s i o n T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tH D P SＧ２Ⅱh a st h e p o t e n t i a lo f i n h i b i t i n g c e l lm i g r a t i o n i nv i t r o,g r o w t ho fm o u s et r a n s p l a n t e d t u m o r a n d i m m u n e r e g u l a t i o n,a n d i t h a s f u r t h e r r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t v a l u e．K e y w o r d s:H o l o t r i c h i a d i o m p h a l i a B a t e s;p o l y s a c c h a r i d e;H D P SＧ２Ⅱ;a n t iＧt u m o r;h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a㊀㊀研究发现,糖类成分在抗氧化[１Ｇ２]㊁癌细胞转移[３Ｇ４]㊁调节机体免疫功能[５Ｇ６]和炎症的发生[７]等方面发挥着重要作用.中药多糖尤其是动物多糖,结构更复杂,活性更广泛[８Ｇ９].蛴螬是朝鲜黑金龟子H o l o t r i c h i ad i o m p h a l i a B a t e s及同属近缘昆虫的幼虫[１０],具有破血㊁行瘀㊁通乳等多种药理作用,主治淤痛㊁痛风㊁破伤风和喉痹等[１１].现有研究表明,蛴螬提取物可抑制肿瘤生长[１２Ｇ１３].本实验用蛴螬提取的总多糖和分离纯化的均一性多糖组分H D P SＧ２Ⅱ进行体内㊁体外抗肿瘤活性研究,探讨其对肝癌的抑制作用.１㊀仪器与材料１．１㊀仪器㊀F DＧ１型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);自动部份收集器,恒流泵(沪西分析仪器厂);电热套(泰斯特仪器公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);离心机(安亭科学仪器厂);S H BＧⅢ型真空泵(城科工贸公司);酶标仪(B i oＧR a d公司);细胞培养箱(T h e r m oS c i e n t i f i c公司);倒置显微镜(N i k o n公司).１．２㊀试药㊀蛴螬购于陕西韩城,由陕西省食品药品监督检验研究院鉴定;环磷酰胺(上海华联制药有限公司);D E A EＧS e p h a d e x AＧ２５㊁S e p h a d e x GＧ７５和S e p h a d e xGＧ１００凝胶(G E H e a l t h c a r e公司);D M E M 高糖培养液(H y c l o n e公司);胎牛血清(G i b i c o公司);S A B C免疫组织化学检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);C D３４单克隆抗体(A b c a m公司).１．３㊀动物与瘤株㊀I C R小鼠４８只,雄性,体质量１８~２２g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供;小鼠腹水型肝癌细胞株H２２由空军军医大学实验动物中心提供;肝癌细胞株H C C L M３和S MM CＧ７７２１购自北京北纳生物有限公司;H e p G２为本实验室传代保株.２㊀方法２．１㊀蛴螬多糖的提取和分级制备㊀将干燥蛴螬粉碎,用４倍体积的无水乙醇提取２h,重复３次.蛴螬残渣用６倍量的氢氧化钠溶液提取２h,３次.所得提取液合并过滤后减压浓缩,置于４ħ冷库中预冷１２h,无水乙醇沉淀１２h后离心,蒸馏水溶解沉淀,反复冻融除蛋白,离心收集上清液,透析,减压浓缩,冷冻干燥,氧化脱色素,得蛴螬总多糖粉末H D P S.称取H D P S粉末８g,溶于１６０m L双蒸水中,０ ４５μm滤膜过滤,滤液上样到D E A EＧS e p h a d e xAＧ２５西北药学杂志㊀２０１９年１月㊀第３４卷㊀第１期h t t p://X B Y Z．c b p t．c n k i．n e t２５凝胶层析柱,梯度氯化钠溶液(依次为０,０．５,１．０,２．０和３．０m o l L－１)洗脱,经苯酚Ｇ硫酸法[１４]检测,根据洗脱曲线主峰位置合并收集液,透析脱盐,减压浓缩,冷冻干燥,得到蛴螬多糖均一性组分H D P SＧ１㊁H D P SＧ２㊁H D P SＧ３和H D P SＧ４.组分H D P SＧ２用双蒸水配制成质量浓度为５０g L－１的溶液,０ ４５μm滤膜过滤,上样至S e p h a d e x GＧ１００凝胶柱纯化,以蒸馏水洗脱,以５m L 管－１收集洗脱液,苯酚Ｇ硫酸法测定,根据绘制洗脱曲线合并相同峰位的收集液,透析,浓缩,冷冻干燥.再用S e p h a d e xGＧ７５凝胶柱进一步纯化,透析,浓缩,冷冻干燥,得到蛴螬均一性多糖组分H D P SＧ２Ⅱ.２．２㊀H D P SＧ２Ⅱ理化性质的鉴定㊀用H P S E C法测定H D P SＧ２Ⅱ的质量分数和相对分子质量:分别配制质量浓度为１０g L－１的标准葡聚糖D e x t r a nTＧ５㊁TＧ１２㊁TＧ５０㊁TＧ１５０㊁TＧ４１０㊁蓝色葡聚糖２００００００及葡萄糖,高速离心;同法制备H D P SＧ２Ⅱ样品,１０μL进样.按照色谱条件检测:S h o d e x S BＧ８０４和S BＧ８０３H Q串联柱;流动相为０．１m o l L－１的硫酸钠水溶液;流速为０．８m L m i n－１;柱温为２５ħ.以标准葡聚糖的分配系数K a v为横坐标(x１)㊁对照品相对分子质量对数值l g M(M指各标准糖的相对分子质量,单位是D a)为纵坐标(y１),求得标准曲线.计算H D P SＧ２Ⅱ的相对分子质量.根据考马斯亮蓝法[１５],以牛血清白蛋白作为标准,测定H D P SＧ２Ⅱ的蛋白质含量;根据硫酸Ｇ咔唑法[１６],以半乳糖醛酸作为标准,测定H D P SＧ２Ⅱ的糖醛酸含量;根据硫酸钡比浊法[１７],测定H D P SＧ２Ⅱ硫酸基含量;根据半胱氨酸Ｇ硫酸法[１８],测定H D P SＧ２Ⅱ中氨基的含量.２．３㊀MT T体外抗肿瘤活性研究㊀参照MT T 法[１９],设置空白组㊁对照组和不同质量浓度给药组(使药物终质量浓度为３~３００m g L－１),测定多糖体外抗肿瘤活性.细胞增殖率＝(A给药组－A空白组)ː(A对照组－A空白组)ˑ１００％.２．４㊀肝癌细胞划痕实验㊀将H e p G２细胞接种于２４孔板中,每孔５ˑ１０５个,培养过夜,用１０μL枪头在培养板底部划痕,用P B S缓冲液冲洗干净划掉的细胞.每孔加入不同质量浓度的多糖无血清培养液５００μL,培养０和４８h后拍照观察迁移距离.实验重复３次.２．５㊀H２２肝癌移植瘤小鼠模型的建立及分组㊀抽取H２２腹水型肝癌细胞株,用预冷的生理盐水清洗３次,并调整密度至１ˑ１０７个 m L－１,以０．２m L接种于小鼠右后背部,２４h后将小鼠随机分成６组:对照组(９g L－１氯化钠溶液)㊁C T X组(腹腔注射C T X ２０m g k g－１)㊁H D P S组(腹腔注射H D P S２０m g k g－１)和H D P SＧ２Ⅱ３个剂量组(高剂量组腹腔注射H D P SＧ２Ⅱ５０m g k g－１,中剂量组腹腔注射H D P SＧ２Ⅱ２０m g k g－１,低剂量组腹腔注射H D P SＧ２Ⅱ１０m g k g－１),每组８只.每日称定质量后,腹腔注射给药.１４d后称定小鼠质量,眼眶取血,处死动物,取皮下瘤㊁胸腺和脾脏,分别称定质量.抑瘤率＝(对照组瘤质量－给药组瘤质量)ː对照组瘤质量ˑ１００％;脏器指数＝脏器质量ː体质量.２．６㊀蛴螬多糖对荷瘤小鼠外周血白细胞(W B C)和淋巴细胞的影响㊀小鼠给药１４d后眼眶取血,用全自动血细胞分析仪检测白细胞和淋巴细胞数量.２．７㊀组织病理形态学观察㊀用质量浓度为４０g L－１的多聚甲醛固定小鼠移植瘤,制备５μm石蜡片,H E染色.观察各组肿瘤细胞生长㊁坏死及对周围组织的浸润情况.２．８㊀检测移植瘤微血管密度㊀免疫组化S A B C法步骤如下:移植瘤石蜡片脱蜡㊁水化后,柠檬酸微波修复抗原㊁灭活内源性过氧化物酶,山羊血清封闭２０m i n,滴加C D３４单克隆抗体(１ʒ２００稀释),４ħ过夜,滴加生物素标记二抗,D A B显色,苏木素复染,自来水返蓝,脱水透明并封片.各组织计数５个视野微血管,取均值.２．９㊀统计学方法㊀应用S P S S１３．０软件进行多个样本均数比较的单因素方差分析和两两比较的t检验.３㊀结果３．１㊀H D P SＧ２Ⅱ的理化性质㊀见图１.由图１可知, H D P SＧ２Ⅱ呈现单一对称峰,表明其为均一性多糖;根据２．２项下方法作相对分子质量标准曲线,回归方程为y１＝－４．４７８７x１＋５．８０９３(r１＝０．９９９２),求得H D P SＧ２Ⅱ的相对分子质量为８．２ˑ１０３D a .图１㊀H D P SＧ２Ⅱ的质量分数和相对分子质量测定色谱图F i g．１C h r o m a t o g r a m o f p u r i t y a n d m o l e c u l a r w e i g h t o f H D P SＧ２Ⅱ㊀蛋白质的含量测定:以蛋白溶液的质量浓度为横坐标(x２)㊁吸光度值为纵坐标(y２),标准曲线为y２＝０．０２１６x２＋０．０４４,r２＝０．９９１５.H D P SＧ２Ⅱ的蛋白３５西北药学杂志㊀２０１９年１月㊀第３４卷㊀第１期h t t p://X B Y Z．c b p t．c n k i．n e t含量为２ ０８％.糖醛酸的含量测定:以糖醛酸溶液的质量浓度为横坐标(x３)㊁吸光度值为纵坐标(y３),标准曲线为y３＝０ ００３３x３＋０．０００６,r３＝０．９９９９.H D P SＧ２Ⅱ的糖醛酸的含量为１２．０８％.硫酸基的含量测定:以硫酸基溶液的质量浓度为横坐标(x４)㊁吸光度值为纵坐标(y４)㊁标准曲线为y４＝０ ００２４x４＋０．０１０７,r４＝０．９９８５.H D P SＧ２Ⅱ的硫酸基含量为０．２４％.氨基的含量测定:以对照品溶液的质量浓度为横坐标(x５)㊁吸光度值为纵坐标(y５),标准曲线为y５＝０ ０４８６x５＋０．１０２,r５＝０．９９９０.H D P SＧ２Ⅱ的氨基含量为４ ８９％.３．２㊀H D P SＧ２Ⅱ对肿瘤细胞增殖和迁移的影响㊀采用MT T法检测H D P SＧ２Ⅱ对肝癌细胞S MM CＧ７７２１㊁H C C L M３和H e p G２生长的影响,发现H D P SＧ２Ⅱ对H C C L M３和S MM CＧ７７２１的生长无明显抑制作用,在高质量浓度时对H e p G２增殖有较弱的抑制作用.结果见图２.细胞划痕实验显示,H D P SＧ２Ⅱ可明显抑制H e p G２细胞的迁移能力.结果见图３.图２㊀H D P SＧ２Ⅱ对肿瘤细胞增殖的影响F i g．２E f f e c t o fH D P SＧ２Ⅱo n t u m o r c e l l p r o l i f e r a t i o n图３㊀H D P SＧ２Ⅱ对H e p G２细胞迁移的影响A．不同浓度H D P SＧ２Ⅱ对H e p G２划痕实验的影响;B．各组划痕愈合宽度分析.与对照组比较∗∗P＜０．０１.F i g．３E f f e c t o fH D P SＧ２Ⅱo nH e p G２m i g r a t i o nA．e f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o fH D P SＧ２Ⅱo n t h ew o u n d s c r a t c ha s s a y o fH e p G２c e l l s;B．a n a l y s i s o f t h ew i d t ho f s c r a t c hh e a l i n g i ne a c h g r o u p．C o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p∗∗P＜０．０１．３．３㊀蛴螬多糖对H２２荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用㊀随着给药时间的延长,C T X组小鼠出现食欲减退㊁皮毛无光泽和反应迟钝的现象,H D P S组和H D P SＧ２Ⅱ高㊁中㊁低剂量组状态较好,体质量与C T X组相比明显增加(P＜０．０５).除H D P SＧ２Ⅱ低剂量组外,各组与对照组比较差异有统计学意义(P＜０．０５).见表１.３．４㊀蛴螬多糖对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响㊀C T X组胸腺指数和脾脏指数均比对照组明显降低, H D P S组胸腺指数较C T X组有所增加,H D P SＧ２Ⅱ组脾脏指数比C T X组明显增高,且随着剂量增加,脾脏指数有增加趋势,胸腺指数有降低趋势(P＜０ ０５).见表２.３．５㊀蛴螬多糖对荷瘤小鼠外周血白细胞和淋巴细胞的影响㊀见表２.由表２可知,C T X组白细胞和淋巴细胞均比对照组明显降低(P＜０．０５).H D P S组和H D P SＧ２Ⅱ各剂量组白细胞和淋巴细胞比C T X组明显增高(P＜０．０５).表１㊀蛴螬多糖对小鼠H２２移植瘤生长的抑制作用T a b．１A n t iＧt u m o r a c t i v i t i e s o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m H oＧl o t r i c h i a d i o m p h a l i a B a t e s o nH２２t u m o r(xʃs,n＝８)组别剂量/m g k g－１体质量增加/g瘤质量/g抑制率/％对照组４．７１ʃ０．８５０．２５ʃ０．０４C T X组２０２．０５ʃ０．８４∗０．１０ʃ０．０４∗６０．０H D P S组２０４．３０ʃ１．３９＃０．１３ʃ０．０７∗４８．１H D P SＧ２Ⅱ低剂量组１０７．３０ʃ１．５０∗＃０．２２ʃ０．１１１２．１H D P SＧ２Ⅱ中剂量组２０６．１０ʃ２．７３∗＃０．１２ʃ０．１４∗５２．０H D P SＧ２Ⅱ高剂量组５０５．４１ʃ０．８１＃０．１１ʃ０．１１∗５６．９㊀注:与对照组比较∗P＜０．０５,与C T X组比较＃P＜０．０５.４５西北药学杂志㊀２０１９年１月㊀第３４卷㊀第１期h t t p://X B Y Z．c b p t．c n k i．n e th t t p ://X B Y Z ．c b pt ．c n k i ．n e t 表２㊀蛴螬多糖对荷瘤小鼠胸腺指数㊁脾脏指数㊁白细胞和淋巴细胞的影响T a b ．２T h y m u s a n d s p l e e n i n d e x e s ,W B Ca n d l y m p h o c y t e n u m b e r s o fH ２２m i c e t r e a t e dw i t h p o l ys a c c h a r i d e s f r o m H o l o t r i c h i a d i Ｇo m p h a l i a B a t e s (x ʃs ,n ＝８)组别剂量/m g k g－１胸腺指数/m gg －１脾脏指数/m gg －１白细胞数量/１ˑ１０９L －１淋巴细胞数量/１ˑ１０９L －１对照组１．６３ʃ０．２２５．５２ʃ０．７９６．７３ʃ１．４８５．４３ʃ１．４４C T X 组２５１．０９ʃ０．２０∗４．１９ʃ０．６５∗１．９８ʃ０．６６∗０．９４ʃ０．３２∗H D P S 组２０１．４８ʃ０．１６＃４．８１ʃ０．４５５．１０ʃ０．６３＃３．７８ʃ０．５０＃H D P S Ｇ２Ⅱ低剂量组１０１．５５ʃ０．１９＃５．２０ʃ０．６６＃７．０８ʃ１．７０＃４．３８ʃ１．２８＃H D P S Ｇ２Ⅱ中剂量组２０１．４２ʃ０．２６５．６７ʃ１．２３＃５．８０ʃ２．２３＃４．００ʃ１．７７＃H D P S Ｇ２Ⅱ高剂量组５０１．３６ʃ０．２９６．６８ʃ０．５６∗＃４．３０ʃ１．４６＃２．６６ʃ１．０９＃㊀注:与对照组比较∗P ＜０．０５,与C T X 组比较＃P ＜０．０５.３．６㊀组织病理学和微血管密度观察㊀肉眼可见荷瘤小鼠H ２２移植瘤体呈结节状,剖面呈鱼肉状,且对照组的肿瘤体积明显大于其他各组.H E 染色结果显示:对照组肿瘤细胞核大且细胞质少,细胞生长旺盛;C T X 组出现大面积坏死的瘤组织;多糖给药组肿瘤细胞结构差异较大,其中H D P S Ｇ２Ⅱ中㊁高剂量组可见明显的肿瘤坏死,坏死程度随剂量增加而增大.结构见图４.C D ３４免疫组化结果显示,蛴螬多糖可抑制肿瘤组织微血管生成,其中H D P S Ｇ２Ⅱ中㊁高剂量组抑制作用较显著.见图５.图４㊀各组肿瘤组织病理观察结果A．对照组;B ．C T X 组;C ．H D P S 组;D．H D P S Ｇ２Ⅱ低剂量组;E ．H D P S Ｇ２Ⅱ中剂量组;F ．H D P S Ｇ２Ⅱ高剂量组.标尺:５０μm .F i g ．４H i s t o p a t h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n r e s u l t s o f t u m o r t i s s u e i ne a c h g r o u pA．c o n t r o l g r o u p ;B ．C T X g r o u p ;C ．H D P S g r o u p ;D．H D P S Ｇ２Ⅱl o wd o s e g r o u p ;E ．H D P S Ｇ２Ⅱm i d d l ed o s e g r o u p;F ．H D P S Ｇ２Ⅱh i g hd o s e g r o u p．S c a l eb a r :５０μm．图５㊀微血管密度观察A．对照组;B ．环磷酰胺组;C ．H D P S 组;D．H D P S Ｇ２Ⅱ低剂量组;E ．H D P S Ｇ２Ⅱ中剂量组;F ．H D P S Ｇ２Ⅱ高剂量组.箭头:微血管;标尺:５０μm .F i g ．５M i c r o v a s c u l a r d e n s i t y ob s e r v a t i o n A．c o n t r o l g r o u p ;B ．c y c l o p h o s p h a m ide g r o u p ;C ．H D P S g r o u p ;D．H D P S Ｇ２Ⅱl o w Ｇd o s e g r o u p ;E ．H D P S Ｇ２Ⅱm e d i u m Ｇd o s e g r o u p;F ．H D P S Ｇ２Ⅱh i g h Ｇd o s e g r o u p．A r r o w :m i c r o v a s c u l a t u r e ;S c a l eb a r :５０μm．５５西北药学杂志㊀２０１９年１月㊀第３４卷㊀第１期４㊀讨论早在«本草纲目»中就有记载蛴螬系微温有毒物.现有研究发现,蛴螬提取物可抑制多种肿瘤生长[２０],并对肿瘤的防治和增强机体免疫功能具有重要意义[２１].本实验通过MT T实验㊁划痕实验和建立H２２肝癌移植瘤小鼠模型,表明蛴螬均一性多糖组分H D P SＧ２Ⅱ体外对肝癌细胞增殖影响较弱,可明显抑制肿瘤细胞的迁移,且体内对H２２肝癌细胞有明显的抑制作用.实验对小鼠免疫器官指数㊁白细胞和淋巴细胞数量进行测定的结果显示,与C T X组相比,蛴螬多糖可明显增加荷瘤小鼠脾脏指数㊁白细胞和淋巴细胞数量,随蛴螬多糖剂量增加,脾脏指数呈上升趋势.免疫组化染色显示,H D P SＧ２Ⅱ可抑制肿瘤局部微血管的形成.结果提示,H D P SＧ２Ⅱ在体内并非直接抑制肿瘤细胞增殖而发挥抗肿瘤作用,而有可能通过抑制迁移㊁调节免疫系统和抑制微血管生成发挥抗肿瘤作用,具体机制有待进一步研究.目前临床上肿瘤的有效治疗都存在严重的免疫抑制,本实验中蛴螬多糖在抑制肿瘤的同时具有一定的免疫调节作用,这种双重作用将保护肿瘤病人机体及各受累器官,并促进临床综合治疗和康复过程,提高病人的生存质量.此研究中,多糖组分H D P SＧ２Ⅱ与蛴螬总多糖相比显示出更强的抗肿瘤活性,说明蛴螬多糖抗肿瘤活性与其结构有关,有待进一步进行构效关系的研究.结果显示,蛴螬多糖H D P SＧ２Ⅱ在抗肿瘤作用的同时,还有一定的免疫调节作用,因此蛴螬多糖有望作为抗肿瘤的新药开发利用.参考文献:[１]㊀张海涛．多糖类化合物抗氧化作用及其机制的研究进展[J]．天津药学,２０１７,２９(３):６０Ｇ６３．[２]㊀Z h 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l a c i d i c p o l y s a c c h a r i d ef r o m t h es i l k m o t ht h a tc a n s t i m u l a t et h ei n n a t ei m m u n er e s p o n s e[J]．C a r b o h y d r P o l y m,２０１６,１３６:９９５Ｇ１００１．[８]㊀C a oH．P o l y s a c c h a r i d e s f r o mC h i n e s e t e a:r e c e n t a d v a n c e o nb i o a c t i v i t y a n df u n c t i o n[J]．I n tJ B i o l M a c r o m o l,２０１３,６２:７６Ｇ７９．[９]㊀霍俊成,李艺杰,李萍,等．药用昆虫多糖的研究进展[J]．现代生物医学进展,２０１７,１７(２９):５７８８Ｇ５７９２．[１０]陈智,郑学燕,朱荣刚,等．蛴螬化学成分及药理作用研究进展[J]．食品与药品,２０１４,１６(１):６２Ｇ６４．[１１]江苏新医学院．中药大词典[M]．上海:上海人民出版社,２００２:２３７９．[１２]刘媛媛,曹蔚,张雅,等．蛴螬生物碱提取工艺及体内外抗肿瘤活性研究[J]．西北药学杂志,２０１４,２９(２):１６０Ｇ１６３．[１３]李基俊,孙抒,杨万山,等．蛴螬提取物对小鼠S１８０肉瘤的抑制作用[J]．中华医学写作杂志,２００３,１０(１５):１３５６Ｇ１３５８．[１４]张璐,张斌,易延逵．毛蜂窝菌多糖提取工艺优化[J]．辽宁中医药大学学报,２０１７,１９(１１):６２Ｇ６４．[１５]董蕊,马卓群,卫功庆,等．不同产地东北林蛙卵胶膜中蛋白质和水解氨基酸含量差异比较[J]．食品工业科技,２０１７,３８(２０):３１２Ｇ３１６,３３５．[１６]马虎强,刘洋,张红,等．骆驼刺茎枝粗多糖的理化性质及抗氧化活性研究[J]．中国药师,２０１８,２１(１):４８Ｇ５２．[１７]丛建波,王长振,李妍,等．褐藻硫酸多糖硫酸基含量测定 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