细胞死活鉴定
区别细胞死活的方法
区别细胞死活的方法
1、活体染色剂—亚甲基蓝溶液以前的教材中，活体染色剂亚甲基蓝溶液可用来鉴别所有有新陈代谢的细胞，利用交换吸附的原理，只有活细胞才能完成交换吸附。
2、胚的染色—红墨水细胞膜在细胞存活时有选择透过性，所以有机染料一般不会吸收，所以用它可以鉴定种子的死活，如玉米细胞是活的，胚没被染红，胚乳被染红。
3、显微镜观察—质壁分离和复原活的成熟的植物细胞有明显的质壁分离和复原现象。
显微镜观察—胞质环流通过细胞质流动实验的观察可以知道，只有活细胞才有胞质环流现象。
4、染色剂—台盼蓝人教版教材中，用台盼蓝染色剂，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜，所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
5、酵母细胞—由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
鉴定细胞死活的方法
鉴定细胞死活的方法
鉴定细胞死活的常见方法如下：
1.显微观察：使用倒置显微镜或荧光显微镜观察细胞形态和结构，判断细胞是否出现明显的形态变化或结构改变。
2.染色方法：使用各种染色剂（如乙酰红胶、甲基蓝、孔雀石绿等）对细胞进行染色，观察染色结果来判断细胞的颜色和形态，从而判断细胞的死活。
3.细胞膜渗透性检测：使用荧光染色剂（如PI、DAPI等）通过细胞膜进入细胞内，观察细胞是否发生荧光变化，判断细胞膜的完整性和死亡程度。
4.细胞内酶活性检测：使用特定的酶底物和荧光染料（如细胞色素c、卡尔比蓝等）对细胞内酶活性进行检测，观察是否发生荧光变化，判断细胞内的酶活性和细胞状态。
5.流式细胞术：使用流式细胞术对细胞进行筛选、分离和分析，通过测量细胞形态、大小、颜色等参数，来判断细胞的死亡程度和数量。
6.细胞增殖检测：通过检测细胞的DNA合成、核分裂或细胞周期等指标，来判断细胞生长和增殖的状态，进而推断细胞的死亡或存活。
值得注意的是，不同的细胞类型和实验目的可能需要使用不同的死活检测方法。
鉴定植物细胞的死活
鉴定植物细胞的死活【试验目的】学习用质壁分别法和用活体染色法鉴定细胞死活【试验原理】活细胞与死细胞在性质上有很多差别，特殊是通透性的变化最为明显。
活细胞的原生质具有选择透过性；而死细胞则为全透性。
选择透过性是质壁分别的先决条件。
因此能发生质壁分别的细胞就表示是活的，不能发生质壁分别的细胞则说明是死的。
死活细胞间不仅通透性不同，而 pH 值等状况也不同，它们对某些染料的反应明显不同。
某些染料能在活细胞的细胞液中积累，但不能染活的原生质；另一方面，这些染料可使死细胞的原生质染色，但不积累于液泡。
所以可依据某些染料活体染色的状况来鉴定细胞死活。
【试验材料和用具】洋葱及其它植物材料、酒精灯、显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、 1M 蔗糖、 0.01% 中性红溶液等。
【试验步骤】1 、用质壁分别的方法鉴定细胞的死活。
撕洋葱表皮细胞滴加 IM 蔗糖中，在显微镜下观看。
细胞很快发生质壁分别，这就是细胞活着的证据。
另把制取的同样制片，用冷冻、加热、干燥、酒精浸泡等方法将它们的细胞杀死，然后取代上述活材料，做质壁分别试验，结果看到已死的细胞不能发生质壁分别现象。
用尿素、硝酸钾、氯化钙溶液等来代替蔗糖，能快速鉴定细胞的死活。
2 、用活体染色的方法的鉴定细胞的死活。
取洋葱或其它材料，用镊子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用锐利的刀片轻轻刮去多余部分），或用刀片做成切片若干，将表皮或切片浸入中性红溶液中，放置 5-10 分钟最出用清水浸洗后置于载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观看。
活细胞一般在液泡内染成红色至紫色，原生质不染色，死细胞常呈橙红色，原生质和细胞核被染色。
撕破的细胞，只剩细胞壁时，呈淡红色或淡紫色。
为进一步鉴别细胞的死活，可把玻片上的水溶液吸去，滴一滴 1M 蔗糖溶液，便可观看到活细胞能发生质壁分别，死细胞及空细胞都有没有这种现象。
可用加热、冷冻或其它方法杀死植物组织，然后用上面所述方法进行处理，比较与活组织有何不同。
细胞死活鉴定
【实验目的】1、回顾细胞培养的有关知识；2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；7、学习实验过程的详细描述及实验记录。
【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
细胞活性鉴定
1、细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其是经过长时间运输和储存的样本。
检测的方法通常有两种：（1）实时的流式检测：利用荧光染料PI、7-AAD或EMA 进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。
此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。
尤其适用于高度坏死的样本。
7-AAD最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC或PE进行多色标记。
但随着时间延长，7-AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。
因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。
EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好的区分固定前的死活状态。
（2）手工检测：使用Trypanblue或其他细胞活性染料。
（3）使用专门的仪器进行检测。
如Vi-cell。
2、7-AAD（7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，在流式细胞术中用于鉴定死细胞，这种作用与PI相似。
它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD 强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。
7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，PI检测时同时占据FL-2和FL-3通道，而7-AAD只占FL-3通道，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V-EGFP/FITC/PE联合使用。
3、Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE（Phycoerythrin）标记的AnnexinV作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。
死活细胞的鉴定方法
活细胞的鉴定在生物学与医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况,需要经常测定细胞的存活率;在肿瘤细胞的研究中,为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力,也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用,例如为了检测某一男子的生育能力,测定精子细胞的存活力就是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法与仪器分析法。
染色法就是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作。
但就是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活,实验结果很容易受操作者的主观因素的影响,存在一定的误差,所以,在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都就是利用了死活细胞在生理机能与性质上的差异。
常用的方法包括染色法与仪器分析法。
1 染色法染色法分化学染色法与荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能与性质上的差异主要包括:死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜就是一种选择性膜,对细胞起保护与屏障作用,只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就就是利用了这一性质。
台盼蓝,又称锥蓝,就是一种阴离子型染料,不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异:就是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝就是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯(FDA)就是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料,其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异:FDA本身不产生荧光,也无极性,能自由渗透出入完整的细胞膜。
死活细胞鉴定
生物探究活动——鉴定植物细胞的死活【实验目的】学习用质壁分离法和用活体染色法鉴定细胞死活【实验原理】活细胞的原生质层具有选择透过性；而死细胞则为全透性。
选择透过性是质壁分离的先决条件。
因此能发生质壁分离的细胞就表示是活的，不能发生质壁分离的细胞则说明是死的。
死活细胞间不仅通透性不同，而pH值等情况也不同，它们对某些染料的反应明显不同。
某些染料能在活细胞的细胞液中积累，但不能染活的原生质；另一方面，这些染料可使死细胞的结构染色，但不积累于液泡。
所以可根据某些染料活体染色的情况来鉴定细胞死活。
【实验材料和用具】洋葱及其它植物材料、酒精灯、显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、1M蔗糖溶液、0.01%中性红溶液等。
【实验步骤】1、用质壁分离的方法鉴定细胞的死活。
撕洋葱表皮细胞滴加1M蔗糖溶液，在显微镜下观察。
细胞很快发生质壁分离，这就是细胞活着的证据。
另把制取的同样制片，用冷冻、加热、干燥、酒精浸泡等方法将它们的细胞杀死，然后取代上述活材料，做质壁分离实验，结果看到已死的细胞不能发生质壁分离现象。
用尿素、硝酸钾、氯化钙溶液等来代替蔗糖溶液，能快速鉴定细胞的死活。
2、用活体染色的方法的鉴定细胞的死活。
取洋葱或其它材料，用镊子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用锋利的刀片轻轻刮去多余部分），或用刀片做成切片若干，将表皮或切片浸入中性红溶液中，放置5-10分钟最后用清水浸洗后置于载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察。
活细胞的液泡内染成红色至紫色，原生质不染色，死细胞常呈橙红色，原生质和细胞核被染色。
撕破的细胞，只剩细胞壁时，呈淡红色或淡紫色。
为进一步鉴别细胞的死活，可把玻片上的水溶液吸去，滴一滴1M蔗糖溶液，便可观察到活细胞能发生质壁分离，死细胞及只剩细胞壁的空细胞都有没有这种现象。
可用加热、冷冻或其它方法杀死植物组织，然后用上面所述方法进行处理，比较与活组织有何不同。
注：1台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
死活细胞的鉴定方法
活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以, 在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
常用的方法包括染色法和仪器分析法。
1染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。
台盼蓝, 又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯（FDA是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体FDA本的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。
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【实验目的】1、回顾细胞培养的有关知识；2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；7、学习实验过程的详细描述及实验记录。
【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的异异酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。
另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。
亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
1.细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点培养条件易改变和控制便于单因子分析便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察在生物学的各个领细2.3.16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图1)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。
每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（万分之一毫升）。
计数时，通常数五个中方格的细胞总数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的细胞总数，然后再换算成1ml细胞悬中的细胞总数。
图 1 血球计数板构造示意图25个中方格的计数板，设5个中方格中的细胞总数为A，细胞悬液稀释倍数为B，则：1mL细胞悬液中的细胞总数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）。
【实验材料】1.试剂：75%酒精、PBS液、细胞培养液、台盼蓝。
2.器具：超净工作台、解剖盘、镊子、剪刀、吸管、移液枪、玻璃培养皿、塑料培养皿、“L”型针头注射器、火柴、酒精棉球、酒精灯、Eppendorf管、离心机、二氧化碳培养箱、记号笔、倒置显微镜、血细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、玻璃离心管，等。
3.材料：小白鼠【实验步骤】小鼠脾细胞原代培养1. 取材：取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3min。
取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。
取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1~2次。
转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2. 分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。
用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。
吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/min，离心1~2分钟。
3. 培养脾细胞：超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。
取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
染色法鉴定细胞死活及活细胞计数1. 试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。
2. 细胞生长状态观察：从培养箱中取出培养物，观察培养液的颜色。
然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。
3. 细胞悬液制备：取0.5mL细胞悬浊液于试管（本实验中，用玻璃离心管代替）中，加1-2滴台盘蓝染液（约0.1ml），混合均匀，染色2min。
4. 细胞计数：滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，细胞悬液依毛细作重新滴加）。
在普通光镜10x物镜下找到中心处的大方格，改用40X物镜，取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量（注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般数上不数下，数左不数右）。
先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。
5. 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：【实验结果】1. 细胞原代培养形态观察图2 倒置显微镜下细胞原代培养图示（10×40）原代培养后的培养液呈粉红色，上清液澄清，未出现异味，也未被污染。
在倒置显微镜下，原代培养的细胞清晰可见，细胞多呈圆形，形状规则，细胞质均匀。
2. 细胞计数（自己原代培养1周的细胞）编号（中格）右上右下左上左下中总数/个15 7 11 12 11死细胞数/个12 6 10 12 8活细胞数/个 3 1 1 0 3细胞存活率= 活细胞数/ 细胞总数×100%=（3+1+1+0+3）/（15+7+11+12+11）×100%=14.29%每毫升液体中细胞的数=[(15+7+11+12+11)/5]×25×104=2.8×106个/m【实验结果分析】本次实验中所测活细胞率为14.29%，比例略微偏低，分析可能有以下原因可能影响实验结果：a) 在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡；b) 在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会影响观察，导致实验失败；c) 取液时没有摇匀细胞液，导致所吸取的细胞悬液中细胞密度较低；d)染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这是导致活细胞比例比较低的重要原因；e)实验中的一些不正确或不规范的操作、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。
【注意事项】小鼠脾细胞原代培养1.小鼠解剖前，一定要在酒精中充分浸泡3min防止杂菌污染无菌操作台；2.分离脾脏时，不要破坏脾脏，注意保持其完整性；3.注入缓冲液要慢而准，且适量，不要撑破脾脏，从头部逐渐向尾部后退，保证细胞分散游离出来，也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；4.时刻注意操作的规范性，避免被杂菌污染，为近一步保证无菌操作台的无菌环境可在玻璃挡板口点燃一个酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；；5.培养前，注意在皿盖上做好标记，切记不要写在皿底，以免影响在倒置显微镜下，细胞形态的观察；原代培养的细胞形态观察6.培养液PH为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞的生长状况；7. 倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察；8.生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。
除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。
游离期细胞一般圆形、折光率高、而衰退期细胞皱缩、透明度下降、立体感很差、较易区分；细胞计数及活细胞率的计算9.当遇到位于大格线上的细胞，一般取上不取下，取左不取右。
【思考题】1.为什么要学习细胞生死状态鉴别的方法？试说明其实际应用意义。
答：在细胞培养的实验室操作以及制造生物制剂时，有时需要确定某舟细胞的生存状态，2.3.胞而更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
4.在动物细胞培养操作过程中，应如何加强无菌操作的观念以避免细胞污染？答：动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用整个实验过程都要有无菌操作概念，避免细胞被污染。
5.组织块贴壁培养时，为什么要将贴有组织块的培养瓶先翻转过来培养？翻转培养瓶的时间不宜过长，为什么？答：为了使组织块略干燥能牢固粘于瓶壁上。
时间过长，则组织粘得太紧，不方便培养。
6.皮肤组织块培养时，要静置培养并尽量减少晃动培养瓶，为什么？答：晃动培养瓶可能会影响细胞的生长，使刚生成的细胞膜破裂。
7.加入培养液后，即可终止胰蛋白酶的消化作用，为什么？答：加入培养液后，细胞获得了足够的养分，也就解除了接触抑制的状态，因此胰蛋白酶的消化作用终止。
8.在细胞传代时，将原培养液倒去后用D-Hank’s工作液洗涤细胞2遍，再加胰蛋白酶，为什么？答：D-Hank’s是常见的平衡盐溶液之一，它是组织基本用液之一、在细胞传代时，要确保传代细胞的细胞的渗透压与培养液保持一致，因此需要用D-Hank’s工作液洗涤，起到过度作用。
【作业】1.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法法等NK细上的促使孟志强等在对健脾理气方(由鳖甲、白术、山楂、党参、白花舌蛇草、枳壳、八月扎、茯苓等组成)进行研究时发现,该方药物血清对体外培养的人肝癌细胞株SMMC27721端粒酶活性有抑制作用。
L IAN等的研究结果表明中草药合剂(含茯苓、当归、黄芩、甘草等)能减少c2myc、bcl22的表达及降低端粒酶催化亚基hTERT的活性,可抑制AN3CA和MCF7 /ADR细胞的端粒酶活性从而导致细胞生存能力的降低。
（3）以DNA拓扑异构酶为靶点筛选天然抗肿瘤药物DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerases)通过DNA 链的切割、转移和再连接来改变DNA的拓扑结构。
DNA拓扑异构酶在细胞代谢过程中起着极其重要的作用,如DNA复制、基因转录、DNA 重组和有丝分裂等。