ELISA稀释液
ELISA稀释液配制
/techniquezones/66抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO4·2H2O0.39克Na2HPO4 1.27克NaCl0.85克NaN3200mgH2O（蒸馏水）至1000ml 2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液pH7.4，PBST NaCl 2.0克KH2PO40.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克KCl0.2克NaN30.2克H2O至1000ml 吐温（Tween）200.5ml4°C保存备用3、包被液（简称CB）pH9.6Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克NaN30.2克H2O至1000ml 密封盖好，4°C存放备用4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.00.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ml)24.3ml 0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/1000ml)25.7ml H2O50ml 4°C存放备用5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6Tris-HCLTris 6.05克HCL(36%) 3.15克（约2.7ml浓HCL）H2O至1000mlDAB为3´，3´二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色6、DAB溶液配制：（组化及Western blot 显色）称DAB30mg，用0.05mol/L pH7.6Trs-HCL缓冲液100ml溶解,如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制使用。
用前加入1%H2O2 1-1.5ml,H2O2浓度为0.01%，混均后使用。
7、3´，3´，5´，5´，-四甲基联苯胺（TMB）溶液配制：用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)或无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4°C保存半年以内使用。
elisa样品稀释技巧
在ELISA实验中，样品的稀释是一个重要的步骤。
以下是一些样品稀释的技巧：
确定稀释倍数：根据实验要求和试剂盒说明书，确定合适的稀释倍数。
通常情况下，ELISA试剂盒都会提供参考浓度范围，可以根据这个范围确定稀释倍数。
准备稀释液：选择合适的稀释液，可以是生理盐水、PBS等。
确保稀释液的质量和纯净度，避免使用含有杂质或沉淀的稀释液。
混合样品：将待测样品与稀释液按照一定比例混合，可以采用手动或自动混匀器进行混合。
确保混合均匀，避免出现沉淀或分层现象。
检测样本：将稀释后的样本加入ELISA板中，按照试剂盒说明书的要求进行后续的孵育、洗涤和检测步骤。
注意遵守实验操作规程，避免操作过程中的误差。
数据分析：根据实验数据，进行统计分析，得出结论。
注意数据处理和分析的正确性，确保结果的可靠性。
需要注意的是，不同实验样本的稀释方法可能有所不同，具体的稀释技巧需要根据实验要求和样本性质来确定。
同时，要保证实验操作过程中的清洁卫生，避免污染和交叉污染。
ELISA检测试剂及方法
ELISA检测试剂1. 包被稀释液：0.05mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.6Na2CO3 1.6gNaHCO3 2.9g加蒸馏水至1000 ml2. 洗涤液（PBST）：10mmol/L PBS(pH7.4)；0.05% Tween-2010mmol/L PBS(pH7.4)NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.42gK2HPO40.27g加蒸馏水至1000 ml3. 封闭液：10mmol/L PBS(pH7.4)；1.0% BSA4. 抗体稀释液：（10mmol/L PBS(pH7.4)；0.05%Tween-20；0.5%BSA）5. 显色液：a. TMB: 称取固体TMB 溶于DMSO 配成1mg/ml液体，4度避光保存，用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将其融化。
b. 底物缓冲液(pH5.0): 柠檬酸1.02g，Na2HPO4.12H2O 3.58g，溶于100ml 水中。
c. 30% 过氧化氢：4℃避光保存。
使用前即时按照下列比列配制：1份TMB加9份底物缓冲液, 加0.01份H2O2即100：900：1。
如：底物缓冲液(pH5.0) 9ml，加TMB 1ml，加30%H2O2 10μl(即配即用)。
ELISA检测准步骤1.标本稀释：抗体稀释液1:5、1:25倍稀释唾液，1:200、1:400倍稀释血清。
2.加入标本：将上述稀释的标本加入已包被的ELISA板，100μl/孔，37℃，60min，洗涤液洗4次。
3.加入酶标抗体：加入1:20，000稀释的HRP标记的羊抗兔IgA。
100μl/孔，37℃，30min，洗涤液洗4次。
4.显色：加入TMB底物显色液，100μl/孔，室温（或25℃）避光显色5-15min，50μl终止液终止反应。
5.检测：450nm测定各孔OD值，均做2孔重复，取平均值计算。
ELISA试剂配制及实验流程
ELISA试剂配制及实验流程ELISA(酶联免疫吸附实验)是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在与浓度。
ELISA试剂是ELISA实验中的关键组成部分，正确配制试剂和正确的实验流程对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。
一、ELISA试剂的配制1. 背景缓冲液（Coat buffer）：该缓冲液用于包被酶标板上的抗原或抗体，并且用于洗涤步骤中的洗板缓冲液。
配制方法：将10 mL Tris缓冲液（100 mM，pH 9.6）加入0.15 g NaCl，搅拌溶解，最后加入一滴Tween-20或其他润湿剂。
2. 试样稀释液（Sample buffer）：该缓冲液用于稀释试样，使其适应ELISA实验的测量范围。
配制方法：根据试样的含量和要求进行合适的稀释，一般可选择PBS （含0.05% Tween-20) 来稀释。
3. 标准品（Standard）：该物质用于建立标准曲线，以根据样品的读数来确定样品中目标物的浓度。
配制方法：首先通过相关实验确定标准品的初始浓度，使用稀释液进行逐步的2倍稀释，以获得不同浓度的标准溶液。
4. 酶标抗体（Enzyme labeled antibody）：该抗体与目标物结合，可与酶底物发生反应产生荧光或颜色。
配制方法：根据抗体的浓度和信号放大的要求，将抗体稀释在稀释液中。
5. 底物液（Substrate solution）：在酶底物的作用下产生颜色，用于测定目标物的浓度。
配制方法：根据酶底物的要求和实验条件，按照相应的方法配制底物液。
二、ELISA实验流程1.包被抗原或抗体：加入适量的抗原或抗体至酶标板孔中，在4°C 下静置一夜或在37°C下孵育数小时，使其吸附到酶标板表面。
吸附后，将酶标板孔洗涤干净以去除未结合的物质。
2.阻断：将阻断液加入酶标板孔中，避免非特异性结合，阻断剂一般为牛血清蛋白、鱼胶蛋白等。
孵育一段时间后，洗涤酶标板孔以去除阻断液。
ELISA试剂配制及实验流程—BDY
ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制：(1)包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M 碳酸盐缓冲液)：CO3 1.59gNa2NaHCO3 2.93g(2)(3)(4)稀释液：牛血清白蛋白0.1 % 0.1g加PBS 缓冲液100ml。
(5)底物缓冲液(PH5.0)：0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L)取25.7ml0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml加蒸馏水至100ml。
(或Na2HPO4·12H2O 1.84g柠檬酸·H2O 0.51g加蒸馏水至100ml)(6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-(7)(8)1.包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。
(简称洗涤，下同)。
2. 封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。
然后洗涤。
3.加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。
4. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
5.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。
37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。
6.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。
7.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应------罗凯明师兄----------包被缓冲液（NaHCO3-Na2CO3缓冲液）量取0.2M?NaHCO3?17mL，0.2M?Na2CO3?8?mL溶于75mL双蒸水中PBS(PH7.2) 称取NaCl?8.0g,?Na2HPO4?12H2O?2.9g，KCl?2.0g，KH2PO4?0.2g溶于1000?mL双蒸水中洗涤液（PBST?PH7.2）量取0.5mL?Tween-20溶于1000?mL?PBS中酶标抗体稀释液量取4mL新生小牛血清CS溶于96mL?PBST中底物液 ???称取OPD?4mg溶于40?mL?3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，临用前配制磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液量取24.3?mL?0.1M柠檬酸钠，25.7?mL?0.2M?Na2HPO4，加双蒸水至100?mL明胶封闭液称取1g明胶溶于100?mL?PBS(PH7.2)中小牛血清封闭液量取10mL小牛血清溶于90mL?PBS(PH7.2)中酶反应终止液（2M?H2SO4）量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中ELISA步骤： ----------根哥给的方法-----------1）实验材料目的抗原BSA或其他对照抗原(15uμg/ml)PBS96孔96孔移液枪封闭液：抗血清HRP-TMB(A，稀硫酸酶标仪2(1). 用(2).(3).以用2h。
ELISA 操作步骤
ELISA 操作步骤•间接ELISA•捕获ELISA间接ELISA默克sigma-aldrich®带你走进抗体的实验室。
试剂和设备1. 磷酸盐缓冲盐（PBS）片剂：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，150mM NaCl（货号P4417）和0.1％叠氮化钠（货号S2002）。
2. 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲胶囊，pH9.6（货号C3041）。
3. 洗涤液（PBS-T）：10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，150mM NaCl，0.05％Tween 20（货号P3563）4. 单克隆一抗。
5. 对照抗体：物种和同种型匹配的非特异性免疫球蛋白（例如作为小鼠单克隆一抗对照的小鼠骨髓瘤蛋白）6. 碱性磷酸酶标记的二抗或过氧化物酶标记的二抗7. 碱性磷酸酶标记的二抗（例如SIGMA FAST™ pNPP片剂，货号 N1891）的底物，或者过氧化物酶标记的二抗（诸如SIGMA FAST™ OPD片剂，货号P9187）的底物。
8. 碱性磷酸酶终止试剂：3 M NaOH（可选）或过氧化物酶终止试剂：3M HCl或3 MH2SO4（可选）9. 微量滴定板10. 配备有405nm或450/492nm滤光片（分别用于pNPP或OPD）的酶标仪。
操作流程•抗原包被•一抗反应•二抗结合•底物制备•显色抗原包被1. 采用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或PBS中制备适当浓度的抗原溶液。
2. 微量滴定板的每个孔中加入0.2ml上述溶液。
3. 37°C孵育30分钟，或4°C孵育过夜（需完全覆盖）。
4. 去除包被液，用PBS-T洗涤三次。
注意：如果发生非特异性结合的问题，可能需要额外的封闭步骤（5％BSA-PBS，30分钟）。
欲了解更多信息，请参阅：Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).一抗反应1. 用PBS-T稀释单克隆一抗。
最佳浓度应使用滴定法来确定。
ELISA说明书翻译
实验步骤1. 开始ELISA 前一天，稀释包被抗体，取酶标板每孔加入100ul 包被抗体溶液，4 度过夜2. 使用前将所有试剂放置室温，强烈建议所有标准品和样品做复孔或三孔，各次检测均要求做标准曲线3. 洗涤液不少于300ul 洗板4 次，并在吸水纸上拍干板子，后续洗涤液同此4. 为了阻断非特异性结合和减少背景，每孔加200ul 样品稀释液5. 封板并在摇床上室温孵育1h6. 在上述期间，准备标准品稀释液和适当的样品稀释液（如必需）7. 标准品稀释：500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml,62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.6 pg/ml, 7.8pg/ml 和0 pg/ml8. 如步骤3 洗板4 次9. 每孔加入100ul 标准品稀释液和样品到对应孔，如有需要可对样品进行稀释10. 封板并在摇床上室温孵育2h11. 如步骤3 洗板4 次12. 每孔加入100ul 已稀释的二抗，封板并在摇床上室温孵育1h13. 如步骤3 洗板4 次14. 每孔加入100ul稀释的HRP,封板并在摇床上室温孵育30min15. 如步骤3洗板5次，每次洗涤洗涤液浸泡30s至1min，有利于减少背景16. 每孔加入100UITMB显色液，并在摇床孵育15-30min，阳性孔将变为淡蓝色，此步无需封板17. 每孔加入100ul 终止液终止反应，阳性孔将由蓝色变为黄色18. 终止反应半小时内测定OD值（450nm）ELISA 实验基本原理基本原理1971 年Engvall 和Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA ）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
ELISA实验详细流程及溶剂配置参考
1溶液配制1.1PBS：磷酸盐缓冲呀（10X）加入双蒸水900ml左右，调节PH7.4，定容至1000ml。
1.2PBST：磷酸盐吐温缓冲液Tween-20为一种非离子表面活性剂，一种去污剂，能够在不破坏蛋白质的情况下，洗脱非特异性结合的抗体。
Tween-20既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是：借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。
洗涤缓冲液：含0.05% Tween-20 的中性PBS（即1*PBST）配置：100ml 10*PBS; 2.5ml 20% Tween-20，定容至1L调节PH7.41.320% Tween-2010g Tween-20, 加蒸馏水约30ml, 可4℃过夜，溶解均匀后定容至50ml。
1.4包被缓冲液0.05mol/L碳酸缓冲液（PH9.6）配制：碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，定容至500ml，测PH9.6.1.5封闭液要求：用4℃预冷的1*PBST配置成2%的BSA溶液配制：10ml 2%BSA封闭液：0.2g BSA粉末，溶解于10ml PBST中，摇晃溶解，后放入4℃冰箱（最好提前一天配制，防止泡沫过多）。
保存：4℃1.6Tris稀释液1.7血样稀释液A.小肽标签稀释液母液：60mg/ml（-80℃保存）配制：1ml 60ug/ml的小肽：1ml 4℃2% BSA 1*PBST+1ul小肽母液，混匀，4℃保存B.血清稀释液血清稀释液：5ug/ml（溶质是小肽，溶剂是封闭液）一块96孔板需要12ml血清稀释液，即11ml的封闭液，1ml 60ug/ml的小肽1.8显色液TMB，是辣根过氧化物酶的常用底物。
在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝色产物。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ELISA 稀释液
简介：
平衡盐溶液(Balanced Salt Solution ，BSS)与细胞生长状态下的pH 值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。
Leagene ELISA 稀释液主要由磷酸氢二盐、磷酸二氢盐、防腐剂等组成，主要用于ELISA 实验中对抗原抗体进行稀释处理。
本试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
自备材料：
1、 96孔板其他固相载体
2、 抗原、抗体
3、 水浴锅
操作步骤(仅供参考)：
1、 一般多用于稀释抗原抗体，或作为空白对照。
2、 按要求包被96孔板。
3、 用ELISA 洗涤液(1×,pH7.4)洗涤数次。
4、 对96孔板或其他固相载体进行封闭处理，一般。
5、 封闭完成后，将包被好的96孔板拍干、密封，4℃保存备用或加入包被缓冲液4℃保存备用。
6、 加入待测血清，空白对照加ELISA 稀释液。
7、 加入配制好的显色底物，37℃水浴20min 。
8、 加入ELISA 终止液终止ELISA 反应。
注意事项：
1、 注意密闭保存，避免挥发。
一旦开封，保质期就会大大缩短。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 IT0035 Storage ELISA 稀释液 100ml 4℃ 使用说明书 1份
有效期：6个月有效。
亦可短期内室温存储。
相关：
编号名称
DC0032 Masson三色染色液
DH0006 苏木素伊红(HE)染色液
NR0003 Lezol(总RNA提取试剂)
PW0082 丽春红S染色液(1×Ponceau S)
TC0699 葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)。