western blotting 原理及体会
western blotting(蛋白免疫印迹)
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蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
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压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
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主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
western blotting 经验原理及问题分析
3、电泳 将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电 流约20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭 电源
4、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，从 凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再加自来水(加几滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脱色， 则可见蛋白质区带清晰。
2) 辣根过氧化物酶-ECL法: 增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化 学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室 内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光 原理,将结果记录下来: ECL显色剂配制:按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀. 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色 液,反应1-5分钟， 用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分 多余的显色液,将一透明的保鲜膜盖住抚平,并确定干的表 面与胶片接触. 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟,冲洗胶片以确定 所测抗原的正确暴光时间,暴光时间可短至几秒也可以长 到数小时. 冲洗胶片步骤:先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者 胶片透明为止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.
0.413ml
0.338ml 12.5ul 2.5ul
过程图
http://202.114.128.248/newkj/my/moban2/index.htm
（二）方法 1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加 至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻 轻加一层异丙醇(约高3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率 不同的界线。 将异丙醇倒去用重蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液 加入分离胶上方，轻轻插入梳子. 待上层胶聚合，拔出梳子,放入 电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3 cm，即可 加样。 2、样品处理： 样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的 上样缓冲液6*SDS，金属浴105°C 10min，加样量一般每个样 品池10~40l。
Western blot电泳原理
WB原理1、电泳是指带电粒子在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）由于无电渗作用，样品用量少（1-100μg），分辨率高，可检出10-9-10-12mol的样品，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶。
SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构。
2、SDS-PAGE原理SDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理根据蛋白质的分子量的差异分离蛋白质，样品处理液中通常加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。
分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。
对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED 的加入量来控制。
一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示。
蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体（或McAb）相应的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后用牛奶将膜上的非特异性的抗原封闭，将膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合（特异大蛋白条带），二抗与一抗结合，即检测样品的待测抗原并可对其定量。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
simple western 原理
simple western 原理Western blotting（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，它可以通过印迹将蛋白质从复杂的样品中分离出来，并在膜上进行检测和分析。
Western blotting有多种不同的实施方法，其中simple western是一种简单且实用的方法，它通常用于研究微量蛋白质的表达水平。
简单西方的原理主要基于蛋白质的固相放射自显影技术。
在此过程中，蛋白质样品首先被印迹到支持物（如硝酸纤维素膜）上，然后与标记的抗体结合，形成免疫复合物。
接着，这些复合物会在支持物上形成可见的放射性图像，从而显示出蛋白质的存在和位置。
具体步骤如下：1. 样品制备：首先，需要从样品中提取蛋白质，并进行定量。
样品可以是组织、细胞、血清或其他生物样本。
2. 印迹：将蛋白质样品印迹到硝酸纤维素膜或其他支持物上。
这一步通常使用湿法转印或干法转印技术。
3. 标记：将放射性标记的抗体与印迹在支持物上的蛋白质复合物结合，标记的抗体可以与蛋白质上的抗原表位特异性结合。
4. 结合和检测：将支持物放入暗盒中，加入标记的抗体和适当的垫圈液进行结合。
通过放射自显影技术，可以检测到放射性标记的蛋白质复合物。
5. 分析：通过观察和分析自显影图像，可以确定蛋白质的存在、相对丰度、位置和相对表达水平。
简单西方的优点在于其简单、快速、成本低廉和可扩展性。
此外，由于不需要使用复杂的化学发光或荧光检测方法，simple western适用于研究微量蛋白质的表达水平，特别是对于那些难以制备大量标准品的蛋白质样品。
然而，simple western也存在一些局限性。
首先，其检测灵敏度受到放射性标记的限制，对于低丰度蛋白质的检测可能存在难度。
其次，由于依赖于放射性物质，simple western可能存在潜在的辐射危害和废物处理问题。
此外，由于需要人工分析自显影图像，simple western在自动化和标准化方面可能存在挑战。
western-blotting
western blotting的原理、操作步骤及意义一。
免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。
免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
westblotting原理
westblotting原理宝子！今天咱们来唠唠Western Blotting这个超有趣的东西的原理哈。
Western Blotting呢，就像是一场在实验室里的“蛋白质大追踪”。
你想啊，细胞里有各种各样的蛋白质，就像一个大杂烩里有好多不同的食材一样。
我们想知道某个特定的蛋白质在里面到底是啥情况，它有多少呀，是不是我们想要研究的那个模样呀，这时候Western Blotting就闪亮登场啦。
它最开始呢，就是要把细胞里的这些蛋白质都给弄出来。
这就好比是从大杂烩里把各种食材都挑出来放在一个大盘子里。
我们用一种特殊的溶液把细胞打破，让蛋白质都释放到这个溶液里。
这时候的溶液就像是一个装满了各种宝藏（蛋白质）的小世界。
然后呢，要对这些蛋白质进行分类排队。
这就用到了电泳这个神奇的技术。
你可以把电泳想象成一场赛跑，不过这个赛跑不是用腿跑的哦。
蛋白质们都带上了负电荷，然后在一个凝胶做成的跑道上开始跑。
小的蛋白质就像那些小巧灵活的小兔子，跑得可快了，一下子就跑到前面去了；而大的蛋白质呢，就像那些慢吞吞的大象，落在后面。
这样，在这个凝胶上，不同大小的蛋白质就按照它们的个头大小排好了队，就像小朋友们按照身高排队一样，整整齐齐的。
接下来呀，我们要把这些排好队的蛋白质从凝胶上转移到一种膜上，这个膜就像是一个特殊的舞台。
我们为啥要这么做呢？因为这个膜呀，后面操作起来更方便。
这个转移的过程就像是把小朋友们从操场（凝胶）带到舞台（膜）上一样。
而且这个膜能够很好地抓住这些蛋白质，不让它们乱跑。
好啦，现在蛋白质都在膜上了。
这时候就像我们在舞台上找特定的小演员一样，我们要找到我们想要研究的那个蛋白质。
这就需要用到抗体啦。
抗体就像是一个超级侦探，它专门寻找特定的蛋白质。
我们把带有标记的抗体放到这个膜上，这个抗体就会在膜上到处找它的目标蛋白质。
一旦找到，就像两个久别重逢的好朋友紧紧抱在一起一样。
最后呢，我们就可以通过检测这个标记来知道我们要找的蛋白质到底在不在这个膜上，有多少。
Western blot原理和技术
八仙过海， 八仙过海，各“显”神通--显色方 神通 法
化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、 无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰 期短 荧光底物法： Krypton ™荧光底物
二抗孵育时加入HRP标记内参 抗体 分子量相差不大 分子量大小相差比较明显
原料是基础--膜
选择种类
NC PVDF 尼龙膜
选择标准
a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结 合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法， 信噪比好）； c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析， 还要根据不同目的来挑选不同的转移膜
预染分子量标准
单色预染 多色预染
修饰分子量标准
预混分子量标准
高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准
预染分子量标准
单色预染 多色预染
修饰分子量标准
糖基化 磷酸化 荧光标记
不可不加--内参的选择
原因：校正蛋白质定量、上 样过程中存在的实验误差 种类：GAPDH、beta-actin、 beta-tubulin 用法：
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测 反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹 分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
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Western blotting 全攻略
蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品印记和免疫学检测三个部分组成。
第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白按分子量大小在凝胶中分成条带。
第二部把凝胶中已分成条带的蛋白转移到一种固相支持物上，常用硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移，它又分为半干法和湿法之分，先打多用湿法。
第三部是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所需要研究的相应抗原。
免疫检测的方法可以是直接的和间接的。
现在多用间接免疫酶标法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的第一抗体的抗体杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。
一、基本原理
第一部分：SDS-PAGE电泳
1、蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷，为了是蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，会进行一些处理，即加入上样缓冲液（loading buffer）。
其中所含的SDS和β-巯基乙醇可破坏蛋白分子间的二级三级结构，断开半胱氨酸残疾之间的二硫键，再经高温处理后，使蛋白完全变性和结聚，形成棒状结构同时整个蛋白带上负电荷；其所含的溴酚蓝，用于监控整个电泳过程；其所含的甘油或蔗糖增大溶液密度，
可加速聚沉样品入凹槽底部。
通电后被负电荷包裹的蛋白在凝胶中向正极移动。
样品先通过高度多孔性的浓缩胶，使蛋白在分离胶表面聚集形成一条很薄的区带。
2、电泳启动后蛋白所带的电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电多者迁移快，反之则慢（电荷效应）；而由于胶孔径小，且成为一个整体的筛状结构，他们对大分子阻力大，小分子阻力小（分子筛效应），最终达到彼此分开的目的。
3、SDS-PAGE胶分离范围：
第二部分：样品的印迹（转膜）
膜的选择：PVDF膜、NC膜、尼龙膜。
我们常用PVDF膜，具有更好的蛋白吸附能力、物理强度以及具有更好的化学兼容性。
PVDF膜及滤纸预处理：转膜前，先甲醇15s，双蒸水2min，再转膜液至少5min。
滤纸转膜前浸湿，赶出滤纸中气泡即可。
注：膜的处理是为了使膜上的部分集团充分活化，更有利于蛋白吸附。
转膜缓冲液：现用现配，其pH为8.3，比大多数的蛋白等电点（pI）
高，因此蛋白带负电荷向阳极移动，所以安装夹层时，应该在黑色夹子一面（阴性电极）依次放上泡沫、滤纸、凝胶、转移膜、滤纸、泡沫。
转膜液中最好不要含有SDS，其会严重影响转印效果；如果蛋白分子量比较大，可以适当加入一点，浓度在0.01%范围内。
电泳后的胶最好再用清水洗下，除去running buffer中的SDS。
转膜时间：
目的蛋白分子大小（kDa）胶浓度转膜时间（h）
80~140 8% 1.5~2.0
25~80 10% 1.5
15~40 12% 0.75
<20 15% 0.5
第三部分：免疫检测
影响抗原抗体反应的因素
（一）电解质
常用1%脱脂奶粉作为抗体稀释液
（二）酸碱度
抗原抗体反应一般在pH为6~8进行
（三）温度
温度升高可以加速分子运动，使结合加速，若高于56℃，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性破坏，在40℃时，结合速度慢，但是结合牢固，常用抗原抗体反应温度为37℃。
此外，适当震荡也可以促进抗原抗体分子的接触，加速反应。
二、基本操作流程：
提取细胞或组织蛋白、测定含量、蛋白样品变性
制备SDS-PAGE胶
电泳
转膜
封闭
一抗
TBST清洗
HRP标记二抗
TBST清洗
ECL发光
X-光片曝光、显影
结果分析
三、操作流程中的细节注意
（一）蛋白样品制备
A、提前制冰，提前打开低温离心机。
B、全部操作需在冰上进行，防降解。
C、提取细胞蛋白需注意：裂解液不要加多，以6孔板为例，每孔一
般为60~100µl，如果细胞密度小，每孔60µl，如果细胞密度大，每孔80~100µl，以增加蛋白浓度，便于后期实验。
D、贴壁细胞需注意：刮细胞时，需均匀，多次。
E、除脑组织等易剪碎样品外，其余组织需在剪碎外，做匀浆处理后，
方可超声。
（二）蛋白样初步定量
蛋白样品初步定量，常用BCA法，后用Thermo 酶标仪测定。
A、BCA法注意事项：
1、检测蛋白浓度时，样品是需稀释再检测
2、先加BCA工作液，再加样本和标准蛋白
B、酶标仪方法：File - 打开– demol – START，即可开始检测，十
几秒内完成测定，插入优盘，导出数据
C、配平蛋白浓度时，每孔上样蛋白不可低于20µg，上样量按30µl
来计算。
D、关于蛋白变性后的分装问题：
a. 若为细胞蛋白，建议不分装，在3~4次内用完，每次需速用
速冻。
（注意：若不分装，则上样时需充分混匀再加样）
b. 若为组织蛋白，由于模型建立复杂，周期长，取样难度大，
可考虑分装，但需充分混匀后分装，速分速冻。
（三）SDS-PAGE电泳
（1）清洗胶板需温柔，轻拿轻放
（2）灌胶需迅速
（3）插梳子时避免将气泡插入梳孔内
（4）电泳时间根据所需最小目标蛋白来确定，使其跑到胶版中下部即可停止电泳
（四）转膜
（1）PVDF膜在预处理前需用蓝色或黑色圆珠笔在相应位置标记所转蛋白名称，便于后期操作。
（2）PVDF膜在可作出实验的前提下，节省使用。
（3）提前制冰。
（4）关于切胶与切膜
a. 若只有一板胶，则用整张膜转整张胶（包含所需蛋白即可），
在孵育不同抗体前，将其剪开；或将裁剪为适当宽度的
PVDF膜直接贴于凝胶的所需蛋白条带的位置。
b. 若为两块以上胶版，可考虑使用切胶法，将两块（或更多）
PAGE胶含所需蛋白的相应位置的凝胶切下，放于一起，
再将其同转在同一个整膜上，便于后期的抗体孵育和显影。
（五）免疫反应
（1）关于抗体孵育时选择自封袋还是摇盒
a. 在第一次做这种蛋白时，可以考虑使用摇盒，使用小摇盒，
每盒需5ml，若培养皿，每皿10ml。
b. 对于小张膜或者单张膜，可以考虑使用自封袋，自封袋节
省抗体。
（2）关于抗体的使用
a. 新到抗体需分装，冰上操作。
b. 在能做出条带的基础上，抗体需节省使用。
c. 一抗可根据经验可重复使用：
如，Bioworld 的GAPDH 在1:5000的稀释基础上，普通情况，至少可重复使用4次。
abcam的LC3B，在1:1000的稀释基础上，至少可重复使
用3次。
d. 二抗使用前需看清所对应的一抗是什么种属，兔源or鼠源。
（3）操作步骤的修改部分：
一抗室温2h，4℃过夜，第二天再室温1h；二抗室温2h。
（六）ECL化学发光，显影，定影
（1）A、B液等体积混匀，手握1min，再滴加在膜表面1~2min，后压片
（2）压片时根据荧光亮度选择压片时间（一张底片根据条带数量可以压多次）
a. 无荧光情况下，选择小压片盒，压片15~30min
b. 荧光微弱情况下，大压片盒，1min、2min、3min、5min
c. 荧光中度情况下，大压片盒，1s、5s、10s、20s、30s、40s、
1min
d. 荧光强的情况下，大压片盒，使其先淬灭一阵，再压1s不
到
四、数据分析
（一）步骤
扫描图片—使用PS反相—使用sigma pro 5抠图，计算灰度，并将数据移入excel —使用SPSS 18.0软件计算ANOV A —作出柱状图1. 扫描图片，标出实验条件
2. 使用PS反相，打开PS软件，文件-打开图片；图像-调整-反相；文件-储存为。
3. sigma pro 5抠图
LC3B
GAPDH
4. SPSS软件
（一）操作步骤：
变量视图
数据视图
分析—比较均值—单因素 ANOVA（方差分析）：两两比较：
选项：。