木霉菌的几丁质酶与植病生防

收稿日期:2002212205作者简介:杨合同(19662),男,理学博士,研究员,主要从事植物病害生物防治研究工作。

文章编号:100224026(2003)0120001208木霉菌的几丁质酶与植病生防杨合同,黄玉杰,郭勇,李纪顺(山东省科学院中日友好生物技术研究中心,济南250014)摘要:木霉菌的几丁质酶是其防治植物真菌性病原菌的主要机制之一,它能降解真菌的细胞壁。

木霉菌的几丁质酶具有结构和编码基因多样性。

已经纯化的木霉菌几丁质酶有内切和外切几丁质酶,壳二糖酶和N 2乙酰2B 2D 2葡萄糖胺酶。

已经克隆的有编码33和422KD a 内切几丁质酶和编码732KD a 的N 2乙酰2B 2D 2葡萄糖胺酶基因。

422KD a 内切几丁质酶是目前研究最多的,已经用于转基因植物的培育;对它的表达和调控也有部分了解。

关　键　词:木霉菌;几丁质酶;基因;生物防治中图分类号:S 43211;S 476 文献标识码:A木霉菌是目前抗真菌的重要生防因子,其抗菌作用的主要机制是重寄生作用,并通过细胞壁降解酶来降解真菌细胞壁,达到防治病害的目的。

在这些细胞壁降解酶中,研究较多的是几丁质酶。

在许多植病生防现象中都发现有几丁质酶的降解过程,如自溶现象以及重寄生现象等。

1　木霉菌几丁质酶及其基因克隆几丁质酶系统与纤维素酶相似,可将几丁质酶划分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和壳二糖酶。

依据酶反应的最终产物将几丁质酶分为三类:(1)内切几丁质酶(EC 31211114),该类酶可随意裂解几丁质和几丁质寡聚物并释放出可溶性低分子量混合物,(Glc NA c )2即双乙酰几丁二糖是主要成分;(2)壳二糖酶,可从非还原端裂解几丁质和几丁质寡聚物[(Glc NA c )n ],释放的最终产物主要是(Glc NA c )2;(3)B 2N 2乙酰氨基已糖苷酶(EC 31211152),同壳二糖酶一样可从非还原端裂解几丁质和几丁质寡聚物,释放N 2乙酰葡糖胺单体(Glc NA c ),它也是唯一可水解(Glc NA c )2的酶。

目前,关于内切几丁质酶和壳二糖酶,以及壳二糖酶和N 2乙酰2B 2D 葡糖胺酶之间的区别还不清楚,有待于详细研究降解底物时的反应变化。

尽管木霉菌的几种几丁质酶已提纯,但几丁质完全水解所涉及的酶类,目前还不清楚。

表1列举了目前木霉菌中研究较多的几种几丁质酶,这些酶的分子量有较大差异,据此第16卷　第1期2003年3月 山东科学SHANDON G SC IEN CE V o l 116　N o 11M ar 12003可以看出木霉菌几丁质酶具有多样性。

422KD a 的内切几丁质酶是提纯次数最多的一类酶,其次是70～732KD a 的N 2乙酰2B 2D 2葡糖胺酶。

木霉菌在以真菌的细胞壁作为碳源时,细胞滤液中一般都含有这两种几丁质酶。

另外,还有人纯化了372KD a 和332KD a 的内切几丁质酶[1],402KD a 壳二糖酶以及282KD a 外切几丁质酶[2],还有人通过荧光染色鉴定了其他的酶,如1022KD a N 2乙酰2B 2D 2葡糖胺酶[3],但未见有关其纯化的报道。

332KD a 的内切几丁质酶的最终产物是壳聚四糖,同时也有少量的壳三糖和壳二糖[1],这种酶不能水解对2硝基酚2B 2D 2壳二糖。

表1　已纯化的木霉菌几丁质酶种类菌株几丁质酶类型分子量KD a T .harz ianumCECT 2413Endochitinase 42,37,33T .atrov irid eP 1Endochitinase ,chitobi osidase ,N 2acetyl 2B 2D 2glucosa m inidase 42,40,73T .cf .harz ianumN ottingha m 39.1Endochitinase ,N 2acetyl 2B 2D 2glucosa m inidase 40,64T .cf .harz ianumN ottingha m T 198Endochitinase 46T .cf .harz ianumN ottingha m 39.1Exochitinase 28T .cf .harz ianum A F 62T 8N 2acetyl 2B 2D 2glucosa m inidase 69 通过对r DNA 的IT S 1和IT S 2序列,线粒体DNA (m tSSU r DNA )的小亚单位和422KD a 同切几丁质酶编码基因ech 42的部分编码区域进行分析,Kubicek (2001)[4]调查了“T .harz ianum ”的8个分离物,并根据形态、生化和生防特性进行分子遗传学鉴定,发现8个菌株分别属于3个不同的种,即T .harz ianum 、T .atrov irid e 、T .asp erellum 。

这8个菌株的培养滤液中都发现了422KD a 内切几丁质酶和732KD a 的N 2乙酰2B 2D 2葡糖胺酶;但利用引物扩增ch it 33的保守区域时,只在T .harz ianum 及其亲缘关系相近的种中能够扩增到特异性产物。

Sch icker ,et al [5]发现几丁质酶染色技术可以区分T .harz ianum 2的不同菌株,说明木霉菌的不同菌株(或不同种群)具有不同的几丁质酶谱或不同的组成成分。

克隆几丁质酶编码基因是检测木霉菌几丁质酶多样性的可靠方法。

目前克隆到的几丁质酶基因如表2所列。

编码422KD a 的内切几丁质酶基因同其他菌株如A p hanoclad ium s p .[6]的几丁质酶基因具有高度同源性,也是经常被克隆的一个基因。

不同木霉菌的ech 42,其核苷酸序列差异高达35%,氨基酸序列差异达17%,这种差异与菌株的系统发育有关[4],是木霉菌系统发育研究领域的一个很有用的基因,可用来鉴别木霉菌的不同种群[7]。

表2　已经克隆的木霉菌几丁质酶编码基因基因木霉菌种类菌株编码的几丁质酶T h 2E n 42T .atrov irid e P 1422KD a endochitinase E ch 42T .atrov irid e I M I 206040422KD a endochitinase Chit 42T .harz ianum CECT 2413422KD a endochitinase Cht 42T .v irens Gv2928422KD a endochitinase T h 2chT .ha m atum Ta m 261422KD a endochitinase E nc 1T .cf .harz ianum T 2521422KD a endochitinase Chit 33T .harz ianum CECT 2413332KD a endochitinase N ag 1T .atrov irid e P 1732KD a N 2acetyl 2B 2D 2glucosa m inidase E x c 1T .cf .harz ianum T 2521732KD a N 2acetyl 2B 2D 2glucosa m i E x c 2T .cf .harz ianum T 2521N 2acetyl 2B 2D 2glucosa m inidase ??・2・山　东　科　学2003年 另外一个克隆次数较多,研究比较详细的几丁质酶基因是T .harz ianum 的ch it 33,在其他真菌中还未发现与该酶的编码基因序列相近的几丁质酶,但它与植物防卫反应涉及的几丁质酶具有高度同源性。

利用其保守区域设计的引物可在其他与T .harz ianum 亲缘关系较近的菌株中扩增到同源片段,而在T .atrov irid e 、T .v irid e 和T .asp erellum 则扩增不到,因此这个基因可能是T .harz ianum 和相近菌株中的特有基因,或者是该基因在亲缘关系较远的菌株中没有足长的保守区[4]。

从T .harz ianum 中克隆了两种N 2乙酰2B 2D 2氨基已糖基酶ex c 1和ex c 2,分别编码64和682KD a 的几丁质酶[1],称为“外切几丁质酶”,两者的氨基酸同源性是72%,其中ex c 1编码642KD a 的几丁质酶,具有7个潜在糖基化位点,与T .atrov irid e [8]的单拷贝nag 1基因相似。

D rabo rg 等[9]发现他所研究的菌株只有一种几丁质酶,其分子量为682KD a ,他认为ech 42中的大部分序列为T .harz ianum 或其相近菌株所特有,T .atrov irid e DNA 与nag 1基因杂交后没有发现任何相似性[10]。

真菌几丁质酶一般与植物几丁质酶¸有高度氨基酸序列同源性[4],但是哈茨木霉菌由ech 42基因编码的几切几丁质酶与细菌几丁质酶和烟草几丁质酶˝有同源性[11],说明该基因应归类到几丁质酶˝。

多数真菌几丁质酶有一信号,有些有几丁质结合区[12],但是有的则没有[11];从木霉菌中克隆的所有几丁质酶基因都没有发现几丁质结合区。

总的来说,从木霉菌中克隆到的几丁质酶的编码基因数目远低于纯化到的几丁质酶数量,几丁质酶及其编码基因都具有多样性,还有很多几丁质酶编码基因有待于克隆。

例如,K i m 等[13]曾经从T .v irens 中克隆到3个编码422KD a 内切几丁质酶的基因。

2　木霉菌几丁质酶的抗菌活性从T .atrov irid e P 1和T .v irens 菌株41中分离到的422KD a 内切几丁质酶、402KD a 壳二糖酶和732KD a 的N 2乙酰2B 2D 2葡糖胺酶能够水解病原真菌的细胞壁,抑制孢子萌发和菌丝生长,如B otry tis cinerea 、Fusarium s pp .、U stilag o avenae 、U ncinu la necator 和其他细胞壁中含有几丁质的真菌[14]。

在同样条件下,木霉菌几丁质酶的生物防治效果要比植物、细菌和其他真菌的几丁质酶好[15],这进一步说明,对于木霉菌来说,这类酶应当是专门降解靶标真菌细胞壁的。

另外,木霉菌的几丁质酶不仅可以水解菌丝顶端的软组织,还可以水解成熟菌丝、分生孢子、厚垣孢子等的“硬”的含有几丁质的组织[16,17]。

3　木霉菌几丁质酶基因的表达与调控在以纯几丁质、真菌细胞壁或菌丝体为唯一碳源时,木霉菌可分泌大量的胞外几丁质酶,但当以脱乙酰壳多糖、纤维素、未纯化的几丁质或昆布多糖为底物时则不分泌或很少分泌几丁质酶;几丁质酶可被可溶解性的几丁质寡聚物诱导,如732KD a 的N 2乙酰2B 2D 2葡糖胺酶和422KD a 的内切几丁质酶[18]。