PCR为基础的反向线点杂交及16S～23S rDNA间区测序分析5种少见类型奴卡菌

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16S和23S rDNA基因序列分析分类鉴定中国衣原体流行株

分子生物学的发展，衣原体分类又引入了分子遗传
学方法。
材料和方法
１材料
１Ｓ和２ＳｒＮ６３Ａ基因序列分析早已在细菌的Ｒ分类鉴定中得到应用。１９９９年国际分类委员会批准了ＥｅｅＤｖｒｔＫＥ等提出的以１Ｓ和２ＳｒＮｔ６３ＲＡ基因序列为基础的衣原体新分类体系… 。新分类中衣原体目共有４个科，中衣原体科分为衣原体属和其嗜衣原体属。衣原体属有３个种：眼衣原体沙
衣原体为严格真核细胞内寄生菌，可在动物和ｐｉａｉ、ｓｔ）流产嗜衣原体（ｈｍｄｐｉｂｒｓ、ｔｃＣｌｙｏｈｌａｏｕ）ａａｔ人中引起多种疾病。２Ｏ世纪出版的伯杰氏细菌学家畜嗜衣原体（ｈａｙｏｈｌｐｃｒｍ、Ｃｌｄｐｉｅｕ）肺炎嗜衣ｍａｏ
ＳＮｉｕ，ＥＪｎＺＯＧＬ－ａＨ，ＨＵ舶，ｔ１ＳａｅａｏａｏａｈｇｎａｄＢｏｅｕｉ，ｎｔｕｅＭｉｏｉｏｙａｄｈｕｅａ．（ｔｔＫｙＬｂｒｔｒｏｔｏｅｎｉｃｒｙＩｓｔｅｙｆＰｓｔｉｔｏｃｂｌｎｆｒｏｇ
ＥｉｍｏｏｙＡａｅｙｏＭｉｔｒＭｅｉｌｃｎｅ。ｅｎ００１Ｃｉ）ｐｄｉｇ．ｃｄｍｅｌｆｌａｙｄａｉｃＢｌｇ１０７．ｈｎｉｃＳｅｓｔｉａ
ＡｂｔａｔＮｎｌｍｙｉｐｄｍｉｔａｎｎＣｉａａｅｃａｓｆｄａｄｃａａｔｒｅｙ１Ｓ２ＳｒＡｅｅｓｑｅｃｎｌｓｒｃ：ｉｅｃｄａｄａｅｉｅｃｓｒｉｓｉｈｎｒｌｓｉｅｎｈｒｃｅｉｄｂ６／３ＤＮｇｎｅｕｎｅａａ－ｉｚｙｉ．Ｔｅｒｐｒａ６／３ＤＮＡｓｑｅｃｓａｅｉｅｔａｈｕｈｔｅｅｓｒｉｓａｅｉｏａｅｒｍｉｅｅｔａｉｌｓｅｉｓｓｓｈｉａｔｌ１Ｓ２Ｓｒｉｅｕｎｅｒｄｎｉｌｔｏｇｈｓｔｎｒｓｌｔｄｆｃａｏｄｆｒｎｎｍａｐｃｅ．ｆ

pcr反向点杂交检测地中海分型报告

pcr反向点杂交检测地中海分型报告PCR反向点杂交检测地中海分型报告一、引言地中海贫血是一种常见的遗传性血液病，主要分为地中海贫血（β-地中海贫血）和地中海贫血症（α-地中海贫血）。

PCR反向点杂交（PCR-RFLP）是一种常用的分子生物学方法，可用于检测地中海分型。

本报告旨在详细介绍PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用。

二、PCR反向点杂交原理1. PCR原理PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写，是一种通过体外扩增DNA片段的方法。

它利用DNA聚合酶酶活性，在特定条件下，使DNA模板得到高效扩增。

2. 反向点杂交原理反向点杂交是一种基于DNA序列特异性识别的方法。

它通过将目标DNA序列与特异性引物结合，并经过适当处理后，通过电泳或其他方法进行检测。

三、PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用1. 样本采集和DNA提取需要从受检者身上采集样本，如静脉血或口腔黏膜细胞。

通过常规方法提取DNA，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

2. PCR扩增使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。

对于β-地中海贫血，通常选择扩增β-地中海贫血突变的片段；对于α-地中海贫血，通常选择扩增α-地中海贫血突变的片段。

3. 酶切反应将PCR产物与适当的限制性内切酶一起进行酶切反应。

限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。

4. 胶电泳分析将酶切产物经过胶电泳分离，并使用合适的染料染色。

在紫外光下观察和记录胶图。

根据不同基因型的特点，可以确定受检者的地中海分型。

四、结果解读根据PCR-RFLP结果，可以得出以下结论：1. 如果在PCR-RFLP分析中观察到明显的限制性内切酶位点差异，即PCR产物经过酶切后出现不同长度的片段，可以判断受检者为地中海贫血（β-地中海贫血）或地中海贫血症（α-地中海贫血）。

2. 通过比对PCR-RFLP结果与已知标准样本的电泳图，可以进一步确定受检者的具体地中海分型。

分子生物学复习题及答案附带模拟考卷

分子生物学复习思考题1．写出分子生物学广义的与狭义的定义，现代分子生物学研究的主要内容，以及5个分子生物学发展的主要大事纪（年代、发明者、简要内容）。

广义上:分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究、以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。

狭义概念:既将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。

其中也涉及到与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。

现代分子生物学研究的主要内容有：基因与基因组的结构与功能，DNA的复制、转录和翻译，基因表达调控的研究，DNA重组技术，结构分子生物学等。

5个分子生物学发展的主要大事纪（年代、发明者、简要内容）:1.1944年,著名微生物学家Avery 等人在对肺炎双球菌的转化实验中证实了DNA是生物的遗传物质。

这一重大发现打破了长期以来，许多生物学家认为的只有象蛋白质那样的大分子才能作为细胞遗传物质的观点，在遗传学上树立了DNA是遗传信息载体的理论。

2. 2.1953年，是开创生命科学新时代具有里程碑意义的一年，Watson和Crick发表了“脱氧核糖核酸的结构”的著名论文，他们在Franklin和Wilkins X-射线衍射研究结果的基础上，推导出DNA双螺旋结构模型，为人类充分揭示遗传信息的传递规律奠定了坚实的理论基础。

同年，Sanger历经8年，完成了第一个蛋白质——胰岛素的氨基酸全序列分析。

3. 1954年Gamnow从理论上研究了遗传密码的编码规律, Crick在前人研究工作基础上，提出了中心法则理论，对正在兴起的分子生物学研究起了重要的推动作用。

4. 1956年Volkin和Astrachan发现了mRNA(当时尚未用此名)。

5. 1985年,Saiki等发明了聚合酶链式反应(PCR)；Sinsheimer首先提出人类基因组图谱制作计划设想；Smith等报导了DNA测序中应用荧光标记取代同位素标记的方法；Miller等发现DNA结合蛋白的锌指结构。

16S-23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针对龟分枝杆菌暴发感染的鉴定

16S-23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针对龟分枝杆菌暴发感染的鉴定张灵霞;庄玉辉;扈庆华【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2001(11)4【摘要】To determine the pathogen of the infection outbreak in Shen Zhen and He bei at gene level with molecular biological technique, and to establish a rapid identification method of M. chelonae subsp. abscessus by dot blot. We designed a oligonucleitide probe and the sensitivity and specificity of the probe were studied. The results showed: the sensitivity of the probe detecting PCR products was 1ng. Only M. chelonae subsp. abscessus was hybridization with the probe, the positive rate of the probe detecting clinical specimen was 66.6%.%该研究旨在采用分子生物学技术，从基因水平上对深圳市某医院及河北辛集地区发生术后及注射后龟分枝杆菌暴发感染的临床分离株进行鉴定，并建立一套快速的的鉴定龟分枝杆菌脓肿亚种的探针杂交方法。

方法：根据龟分枝杆菌脓肿亚种标准株16S一23S rDNA间隔区序列测序结果，设计一对寡核苷酸探针，对其敏感性、特异性及其对临床标本和临床分离株的检测进行了研究。

结果：探针检测PCR扩增产物敏感性为1ng，只与龟分枝杆菌脓肿亚种杂交，与56株龟分枝杆菌脓肿亚种临床分离株全部杂交；检测57株临床标本阳性率为66.6％。

16S～23S rDNA间隔区序列在分枝杆菌分类鉴定中的应用研究

作者简介：张灵霞（!"#$%），女，河南省人，硕士，现在三!九医院从事分枝杆菌分类鉴定的研究!*+!$,+-./0间隔区序列在分枝杆菌分类鉴定中的应用研究张灵霞庄玉辉何秀云张晓刚李国利（中国人民解放军,’"医院结核病研究室北京!’’’"!）摘要：采用聚合酶链反应（123）技术对分枝杆菌!*+!$,+-./0间隔区序列进行扩增，其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（1045），并通过计算机聚类分析，在基因水平上评价其对分枝杆菌分类与鉴定的意义。

退火温度6(7时，123扩增的敏感性为(’’89／":，而(’7时的敏感性为(;9／":。

已通过对$$种分枝杆菌和"种非分枝杆菌的特异性实验，结果表明：扩增条带多集中在,’’!*’’<;之间，多数受试快速生长分枝杆菌和非分枝杆菌扩增条带多且分子量较大，缓慢生长分枝杆菌扩增条带相对较少，分子量较小。

1045和计算机聚类分析结果显示，分枝杆菌种间条带特异性的相似性系数均小于#’=，且绝大多数菌种间小于(’=。

可将被试菌株鉴定到种的水平。

1045和聚类分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。

关键词：分枝杆菌，123，聚类分析，分类鉴定中图分类号：>","文献标识码：0文章编号：’’’!&*$’"（$’’’）’(&’6("&*6已报道的分枝杆菌有一百多种，其中一小部分对人与动物有致病性。

非结核分枝杆菌引起的肺部疾病，其临床表现、体征和?线影像酷似结核病，但治疗方案不同。

因此菌种分类、鉴定对于结核病的诊断、治疗和流行病学调查至关重要。

生物学特性及细胞生化试验一直是菌种鉴定的经典方法，各具特有的优点。

但这些方法操作繁杂或敏感性低，或特异性差，而且费时，有其局限性。

近年来报道了一些新的检验鉴定技术：!、./0探针杂交，一种快速可信的菌种鉴定方法，但只能应用于部分分枝杆菌的鉴定［!］。

16S—23S rDNA间隔序列PCR与RELP对分支杆菌临床分离株的鉴定价值

16S—23S rDNA间隔序列PCR与RELP对分支杆菌临床分
离株的鉴定价值
张灵霞;庄玉辉
【期刊名称】《中国防痨杂志》
【年(卷),期】1998(020)003
【摘要】为阐明分支杆菌同种临床分离株不同菌株之间以及与标准株之间１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列是否有差异，以及结核分支杆菌耐药性和１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列有无关系。

本文对５８株结核分支杆菌临床分离株（２０株敏感株，３８株耐药株）和淡黄、副偶然、母牛等分支杆菌的临床分离株的１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔序列进行了扩增，并对扩增产物进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳及限制性内切酶ＨａｅⅢ、Ｍｓｐ
【总页数】3页(P140-142)
【作者】张灵霞;庄玉辉
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R378.911
【相关文献】
1.16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究 [J], 李国利;庄玉辉;赵铭;王国冶;陈保文;沈小兵
2.16S-23S rDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆菌暴发感染的
研究 [J], 张灵霞;庄玉辉;池英藩;邱志强;王玮;刘坦业;池细弟;高世华;林蓉金
3.分支杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析 [J], 彭涛;温博海;蹇锐;钟敏
4.利用16S～23S rDNA间隔序列对葡萄酒中的酒酒球菌的鉴定 [J], 周利国;刘树文;李西柱;王坐京
5.柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析 [J], 鹿连明;姚锦爱;张利平;胡秀荣;黄振东;陈国庆
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16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA

【Key words】 rRNA Bacteria Polymerase chain reaction Hybridization
细菌培养、组织学、免疫学方法虽广泛应用于对病原菌的检测，但都存在一定的不足［1，2］。为探索快速可靠的诊断方法，我们在细菌保守的16SrRNA基因内，自行设计并建立了聚合酶链反应(PCR)加反相杂交检测所有细菌DNA的方法，取得了较好的结果，现报告如下。
表2 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针序列及有关参数
Байду номын сангаас
序列5′-3′
所在基因位置
引物1 5′-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3′ 1521～1539
引物2 5′-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3′ 1187～1169
通用探针 5′-CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC-3′ 1368～1394
二、方法
(一)标本DNA抽提菌株DNA制备用经典酚-氯仿抽提，临床血白细胞DNA抽提，采用本实验室建立的方法［2］。所有试剂均以0.22μm孔径滤菌器过滤分装。抽血专用工作台每日消毒2次，每次1小时。抽血过程严格无菌操作。
(二)16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针的设计与合成引物选自细菌16SrRNA基因保守区内，经计算机软件辅助设计，上海细胞生物研究所合成。同时设计了3条寡核苷酸探针，分别是对所有细菌共用的通用探针，对革兰阳性菌特异的探针及对革兰阴性菌特异的探针。引物序列及有关参数见表2。为使引物5′端带有生物素基因，以便PCR扩增后进行反相杂交，在DNA合成仪合成引物到最后一个核苷酸时，改用Tritylon程序，加入Link-NH2，反应后引物的5′加上一个带NH2的基因。待NH4OH去掉保护基后，以琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)在其NH2上生物素化。

PCR-RFLP分析16s-23srDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

ａａｏｅｇｌｅｅｔｏｈｒｓｓＡＥａｄｈｒｓｌｓｉｅｔｄｙｈｅｔｉｔｏｎｙｅｓｏｅｇｒｓｅｌｃｒｐｏｅｉ（Ｇ）ｎｔｅｅｕｔｄｇｓｅｂｔｅｒｓｒｃｉｎｅｚｍｓｈｗｄ
枝杆菌扩增片段集中在４５ｂ，单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定３．％的受试菌种，酶０～５Ｐ７７３３
切结果显示：分枝杆菌的酶切图谱彼此不同结论
是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。
１～２ＤＡ间区序列ＤＡＣｓｓＮ６３ｒＮＰＲ扩增和ＲＬ分析ＦＰ
ｔｉｎｈｗｅｔｔ１ｒｂｎｄｗｅａｗａａｐ１ｆｉｉｔｍｏｃｒｉｓｒｎｔａｔｈｅｏｓｏｄｈａｏ２ａｓｒｅｌｙｓｍｉｅｄｎｈｅｙｃｂａｔｅａｌｔａｉｓ，ｈｔａｍｐｌｆｅｆａｇｎｏｓｌｗｒｏｅｍｃｏａｅａａｓｎｅｅｗｅｎ４ａｄ８ｂｐｒｐｉｇｏｒｉｉｄｒｍｅｔｆｏｇｗｒｙｂｃｔｒｉｗｏｂｔｅ３０ｎ４０，ａｄｒｗｅｍｙｏｃｅａ４０ｎ５７ｂ３３ｓｒｎｓｏｕｌｂｉｅｉｉｄｙｈａｐｌｆｅｐｏｕｃｓｃｂａｔｒｉ７ａｄ５ｐ．３．％ｔａｉｃｄｅｄｎｔｆｅｂｔｅｍｉｉｄｒｄｔｏｆ
ＭｓｐＩ，ｂｗｈｉｈｈｅｙｃｔｄｉｅｒｎｃｅａｍｇｈｅｍｆｆｅｓｏｎｔａｐｌｉｅｆａｇｎｔａｎｄｍｏｔｈｒｅｓｒｉｆｉｄｒｍｅｓａｎｇｅｔｃｔｉｎｏ

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（．ＤｐｒｅｔｆＤｒａｏｇｎｅｅｌｙｈｆｌｔｏｉｌＩｎｒｎｏｉＭｅｉｌｏｅｅＨｈｏ００５Ｃｉａ２１ｅａｔｎｏｅｔｏｙａｄＶｎｒｏ，ＴｅｉｉｅＨｓｔｎｅＭｏｇｌｄｃｌｇ，ｏｈｔ１００，ｈｎ；ｍｍｌｏｇＡａｄｐａｏｆａａＣｌ
２１０１年８月
首都医科学学报大
ＪｕｎｌｏａｉｌＭｅｉａｉｅｓｔｏｒａｆＣｐｔｄｃｌＵｎｖｒｉｙａ
Ａｕｇ２．０１１
第３２卷第４期
Ｖｏ．２Ｎ．１３ｏ４
［ｏ：０３６／．ｓｎ１０－７５２１．４０７ｄｉ１．９９ｊｉ．０６７９．０１０．０］ｓ
【关键词】奴卡菌；６一３Ｎ１Ｓ２ＳＤＡ基因内转录间隔区；ｒ内转录间隔区基因序列型；向线点杂交；逆内转录区逆向线点杂交型
【中图分类号】Ｑ７８
ＲｅｅｓｉｌｔｈｂｉｚｔｏｎｖｒｅｌｎｅｂｏｙｒｄｉａｉｎａｄＤＮＡｅｕｅｉｔｉｓｏｈｓｑｎｃｎｇｓｕｄｅｆｔｅ
【要】目的摘
探讨５种新出现的奴卡菌种１Ｓ～２ＳｒＮ６３ＤＡ内转录间隔区（ｎｅａｔｎｃｉｅｐｃｒＩＳＤＡ基因序列的多ｉｔｎｌｒｓｒｄｓａｅ，）ＮｒａｂＴ
对６例奴卡菌标本进行ＩＳ基因扩增、Ｔ克隆、测序，
ＣｎｅｏｆｃｏｓｉａｅａｃｂｌｙｈｅＵｉｒｔｏｙｎｙｅｔｅｄＨｓｉｌｅｔｅｄＮｗＳｕａｅＮＷ１５ｅｔｆｒｎｅｔｕＤｓｓｎＭｉｏｉｏ，ＴｎｅｉＳｄｅ，Ｗｓａｏｔ，Ｗｓａ，ｅｏｔＷｌＳ２４ｒＩｉｅｓｄｒｏｇｖｓｙｆｍｐａｍｈｓ
【ｂｔｃ】ＯｊｃｖＴｘｍｎＮｅｕｎｅｐｌｏｈｍｅ１Ｓ一３ＤＡｇｎｔｎｌｒｓｉｄｓａｅ（）ＡｓａｔｒｂｅｔｅｏｅａｉＤＡｓｅｃｏｍｒｉｓｎｔ６２ＳｒＮｅｅｉｅａｔｎｒｅｐｃｒＩｉｅｑｙｐｓｉｈｎｒａｃｂＳＴ
１Ｓ—２Ｓｒ６－３ＤＮＡｅｅｉｔｒａｒｎｃｉｅｐｃｒｒｇｏｓｏｖｇｎｎｅｎｌｔａｓｒｂｄｓａｅｅｉｎｆｆｅｉ
ｅｅｇｎｇｐｔｇｎｃＮｏａｄａｓｃｅｍｒｉａｈｏｅｉ查特异的奴卡菌种逆向线点杂交（ｅｅｓｎｌ，Ｌ）ｒｖｒｌｅｏＲＢ探针。方法ｅｉｂｔＩＳ因测序分析，Ｔ基以鉴别不同的奴卡菌种及种内分型。结果
设计奴卡菌种特异探针及ＩＳ间区ｒＮＴＤＡ基因特异的探针，进行以ＰＲ为基础的ＲＢＰＲＲＢ杂交试验，同的ＲＢ型进行ＣＬ（Ｃ／Ｌ）不Ｌ发现２个Ｎｃｒｉｂｉｇｎｉ菌株ＩＳ间区有８基因序列型，ｏａｄａｅｉｅｓｊｎｓＴ个４个ＲＢ型；ｔａａｄｃ４个基因序列型及ＲＢ型；ｂｃｌｋｅ５个基因序列型，ＲＢ型，中ＮｂａＲＢｌ型与所Ｌｈｉｎｉｌａ有Ｌｌｋｏｉ有ａｃａ３个Ｌ其．ｌＬｌＩ
Ａｔｌ：．ＤｐｒｎｏＤｒａｏｇｎｅｅｌｙＸａｗｏｉｌＣｐｔｌｄａｎｅｉ，ｅｎ００３，ｈｎ）ｓａａｕｒｉ３ｅａｔｔｅｆｍｅｍｔｏｙａｄＶｎｒｏ，ｕｎａＨｓｔ，ａｉｉｌＵｉｒｔＢｉｇ１０５ＣｉａｌｏｇｐａａＭｅｃｖｓｙｆ
・皮肤病与性病学专题
・
ＰＲ为基础的反向线点杂交及１Ｓ～３ＤＡ问区Ｃ６２ＳｒＮ测序分析５种少见类型奴卡菌
王晓彦孔繁荣。连石
（．内蒙古医学院附属医院皮肤性病科，１呼和浩特００５；．澳大利亚悉尼大学Ｗｅｔａ１００２ｓｄ医院微生物与感染中心，ｍｅ悉尼ＮＷ２４；．首都医科大学宣武医院皮肤性病科，京１０５）Ｓ１５３北００３
有ＮｌＩＳ探针杂交没有信号；ｅｇｎ有５个基因序列型，ＲＢ型；ｖａｅ５个基因序列型，ｂａＴ — ｌａｓｅ３个Ｌｉｃａ有ｎ２个ＲＢ型。结论Ｌ
通过ＰＲＲＢ试验，Ｃ／Ｌ准确的ＩＳ基因测序认识了新出现的菌种， Ⅳ ｅｉｇｕｉ，．ｂｃｌｋｅｅｇｎ，－ｈｉｎｉＴ即＿ｂｉｎｅｓｉｌｋｃｉ，ｌａｓⅣ ｔａｌｄｃｊｓＶａｏａｅａａ及ｖａｅ。同时建立了可以大量筛查奴卡菌种的ＰＲＲＢ方法，ｉｅａｎＣ／Ｌ以进行快速临床诊断及流行病学研究。