β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)
pcr反向点杂交检测地中海分型报告
pcr反向点杂交检测地中海分型报告PCR反向点杂交检测地中海分型报告一、引言地中海贫血是一种常见的遗传性血液病，主要分为地中海贫血（β-地中海贫血）和地中海贫血症（α-地中海贫血）。
PCR反向点杂交（PCR-RFLP）是一种常用的分子生物学方法，可用于检测地中海分型。
本报告旨在详细介绍PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用。
二、PCR反向点杂交原理1. PCR原理PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写，是一种通过体外扩增DNA片段的方法。
它利用DNA聚合酶酶活性，在特定条件下，使DNA模板得到高效扩增。
2. 反向点杂交原理反向点杂交是一种基于DNA序列特异性识别的方法。
它通过将目标DNA序列与特异性引物结合，并经过适当处理后，通过电泳或其他方法进行检测。
三、PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用1. 样本采集和DNA提取需要从受检者身上采集样本，如静脉血或口腔黏膜细胞。
通过常规方法提取DNA，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
对于β-地中海贫血，通常选择扩增β-地中海贫血突变的片段；对于α-地中海贫血，通常选择扩增α-地中海贫血突变的片段。
3. 酶切反应将PCR产物与适当的限制性内切酶一起进行酶切反应。
限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。
4. 胶电泳分析将酶切产物经过胶电泳分离，并使用合适的染料染色。
在紫外光下观察和记录胶图。
根据不同基因型的特点，可以确定受检者的地中海分型。
四、结果解读根据PCR-RFLP结果，可以得出以下结论：1. 如果在PCR-RFLP分析中观察到明显的限制性内切酶位点差异，即PCR产物经过酶切后出现不同长度的片段，可以判断受检者为地中海贫血（β-地中海贫血）或地中海贫血症（α-地中海贫血）。
2. 通过比对PCR-RFLP结果与已知标准样本的电泳图，可以进一步确定受检者的具体地中海分型。
血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血的效用分析
血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血的效用分析发布时间：2022-06-08T06:08:33.153Z 来源：《医师在线》2022年2月4期作者：覃学占[导读]覃学占（贵港市人民医院；广西贵港537100）[摘要]目的：对比分析血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血的效用。
方法：研究选取我院2020年1月-2022年2月收治的产前地中海贫血患者86例，随机将其分为观察组与对照组，每组各43例，观察组行血红蛋白电泳联合PCR-反向斑点杂交法检测；对照组仅行血红蛋白电泳检测，对比分析检测两组效果。
结果：经过对比后发现，观察组疾病的确诊率为100.00%，对照组疾病的确诊率97.67%，观察组对疾病的确诊率明显高于对照组。
观察组能准确的显示基因突变的类型。
P<0.05，差异具有统计学意义。
结论：地中海贫血患者应用血红蛋白电泳联合PCR-反向斑点杂交法检测，能提高对疾病确诊率的同时可以明确基因突变的类型，为进一步的诊疗提供了有力的数据支持。
关键词：血红蛋白；电泳；PCR-反向斑点杂交；β-地中海贫血贫血是人体红细胞低于正常范围的下限，引起一系列症状，甚至导致器官病变的疾病。
据相关数据统计，全球贫血的患病率高达24.8%，而孕妇贫血的概率达41.8%，相对来说女性患贫血的概率更高一点。
地中海贫血与传统贫血有一定的差异，地中海贫血是遗传缺陷疾病，珠蛋白基因链的缺失或突变而导致的慢性溶血性贫血[1]。
研究选取我院收治的产前地中海贫血患者，旨在对比分析血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血的效用。
1资料与方法1.1临床资料研究选取我院收治的产前地中海贫血患者86例，随机将其分为观察组与对照组，每组各43例。
观察组年龄范围（24-36）岁，平均年龄（30.12±2.13）岁，平均BMI（24.17±1.01）KG/cm2，平均血红蛋白（90.29±10.46）g/l，首次妊娠22例，2次及以上妊娠11例；对照组年龄范围（24-35）岁，平均年龄（30.75±2.24）岁，平均BMI（24.09±113）KG/cm2，平均血红蛋白（90.32±10.18）g/l，首次妊娠20例，2次及以上妊娠13例。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件
35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。
β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
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IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
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βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)
pcr扩增
DNA提取
利用特定的试剂从血细胞中提取出DNA。
pcr扩增
使用聚合酶链式反应（PCR）技术对DNA进行扩增，使其数量增加，便于后续 的检测。反向点Fra bibliotek交制备探针
将目标基因序列设计成特定的探针，并固定在尼龙膜上。
杂交反应
将扩增后的DNA与固定在膜上的探针进行杂交，通过碱基互 补配对原则，将目标基因序列特异性地结合在膜上。
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高检测的灵敏度和特异性，降 低检测误差。
要点二
基因组编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，对β-地中海贫血基因 进行精确编辑和修复，从根本上治疗地中海贫血。
临床应用的拓展
早期筛查
将β-地中海贫血基因检测纳入新生儿筛查 计划，实现早期发现和干预，降低疾病对 患儿的影响。
β-地中海贫血基因检测(pcr反向点杂交法)
• β-地中海贫血基因检测介绍 • pcr-反向点杂交法介绍 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)流程 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)的临床意义
• β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点 杂交法)的未来发展
01
β-地中海贫血基因检测介绍
03
耗时长：需要进行PCR扩增和杂交反应， 整个过程需要一定时间。
04
对实验条件要求高：需要严格控制实验条 件，避免交叉污染和假阳性结果。
03
β-地中海贫血基因检测(pcr-反 向点杂交法)流程
样本采集和处理
血液样本采集
从患者静脉抽取适量血液，用于 后续的基因检测。
样本处理
将采集的血液进行离心，分离出 血浆和血细胞，保留血细胞用于 后续的DNA提取。
地中海贫血基因检测研究进展
地中海贫血基因检测研究进展施建刚广西壮族自治区贵港市人民医院检验科，广西贵港 537100[摘要] 地中海贫血在临床上也称为“海洋性贫血”，是一组遗传性溶血性贫血疾病。
根据流行病学的相关调查数据显示，地中海贫血的高发区域为东南亚，在我国多分布于两广、四川等地。
目前，地中海贫血基因检测是预防地中海贫血胎儿活产的主要检测方法，也是诊断出地中海贫血疾病的重要手段。
而随着各类检测技术的快速发展，地中海贫血基因检测技术质量也在不断提高，逐渐应用于临床诊断中。
[关键词] 地中海贫血；基因；检测；进展[中图分类号] R556 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2020）23-50-04Research progress of thalassemia gene detectionSHI Jian'gangDepartment of Clinical Laboratory, Guigang City People's Hospital, Guangxi, Guigang 537100, China[Abstract] Thalassemia, also known as 'marine anemia', is a group of hereditary hemolytic anemia diseases. According to epidemiological survey data, the high incidence area of thalassemia is Southeast Asia, and it is mostly distributed in Guangdong, Guangxi and Sichuan, etc. of China. At present, thalassemia gene detection is the main detection method to prevent live birth of thalassemia fetus, and it is also an important method to diagnose thalassemia disease. With the rapid development of various detection technologies, the quality of thalassemia gene detection technology is also constantly improving and gradually applied to clinical diagnosis.[Key words] Thalassemia; Gene; Detection; Progress[基金项目] 广西壮族自治区卫生健康委员会科研课题（Z20190320）。
反向点杂交法检测β地中海贫血在产检中的应用
反向点杂交法检测β地中海贫血在产检中的应用
杨柳光;巢薇;李卓园
【期刊名称】《齐齐哈尔医学院学报》
【年(卷),期】2006(027)016
【摘要】目的探讨反向点杂交(RDB)法检测在产检中筛查β地中海贫血的应用价值.方法采用RDB法,检测54例临床似诊为β地中海贫血患者.结果在54例样本中,检出β地贫基因携带者17人.结论 ROD法在检测β地贫中,具有高通量、特异性强、操作简便无需接触放射性等优点.
【总页数】2页(P1981-1982)
【作者】杨柳光;巢薇;李卓园
【作者单位】广西柳州市工人医院检验科,545005;广西柳州市工人医院检验科,545005;广西柳州市工人医院检验科,545005
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.反向点杂交法在β-地中海贫血基因诊断中的应用 [J], 荣卡彬;李运雄;陈冬;陈和平
2.应用PCR-反向点杂交法检测β-地中海贫血基因点突变 [J], 吕燕波;潘兴华;徐庆玲;刘林;邓永丽;王金祥;石琳琳
3.应用反向点杂交法诊断β地中海贫血基因型 [J], 饶兆英;周红平
4.应用反向点杂交法检测α-地中海贫血点突变 [J], 郭广洲;陈延娥;廖生赟;周敏
5.应用反向点杂交法产前诊断β-地中海贫血375例 [J], 李坚;李冬至;廖灿;冯琼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
不同基因型地中海贫血的血液指标分析
临床探索不同基因型地中海贫血的血液指标分析杨鑫城 （重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010）摘要：目的：比较不同类型地中海贫血患者在血液学指标方面的差异。
方法：地中海贫血基因检测采用PCR体外扩增结合其他分子诊断技术。
血液指标参数采用BC-6800全自动血细胞分析仪进行检测。
结果：检出静止型α-地中海贫血10例，分别为αQSα/αα 2例、–α4.2/αα 1例、–α3.7/αα7例；标准型α-地中海贫血检出基因型全部为—SEA/αα。
β0地中海贫血主要基因型为CD17/N；β+地中海贫血基因型全部为IVS-Ⅱ-654/N。
与对照组相比，研究组的HGB、MCV、MCH、MCHC均降低，RDW-CV均升高，差异有统计意义（P＜0.05）。
结论：重庆医科大学附属第二医院片区α-地中海贫血中以标准型α-地中海贫血为主，基因型—SEA/αα检出率最高。
β-地中海贫血以β0地中海贫血居多，主要检出基因型为CD41-42/N和CD17/N 。
RBC、MCV、MCH、MCHC、RDW-CV等血液学指标可以作为地中海贫血的初筛指标。
关键词：地中海贫血；基因突变类型；血液学指标地中海贫血，简称地贫，又称海洋性贫血，最早发现于地中海区域，是由于人体遗传的珠蛋白基因突变或缺失，导致其指导合成的珠蛋白链合成缺如或者不足的慢性溶血性贫血[1~3]。
目前，基因诊断是地中海贫血确诊的金标准，但是基因诊断方法耗时长且昂贵，很多基层医院无法开展，因此很有必要建立一个针对地中海贫血患者血液学指标的筛查策略。
本研究以重庆医科大学附属第二医院（下称附二院）地中海贫血基因检测阳性的患者为对象，具体分析地中海贫血的基因型、构成比和血液指标，探讨血常规参数在地中海贫血初筛中的意义。
1资料与方法1.1 研究对象收集2019年8月~2020年3月就诊于本院的地中海贫血患者71例，对照组为地中海贫血基因检测结果为正常健康体检者30例。
1.2 血常规检测采用迈瑞B C-6800血细胞分析仪对红细胞数R B C（×1012 /L）、血红蛋白量HGB （g/L）、平均红细胞血红蛋白量MCH（pg）、平均红细胞体积MCV（f l）、平均红细胞血红蛋白浓度MCHC（g/L）、红细胞分布宽度变异系数RDW-CV（%）这五项血常规参数进行检测。
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35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管 B液 40ml
42 ℃预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
42 ℃洗涤15min
【原理】
PCR技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链， 在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复 制成同样的两分子挎贝。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其 特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
【原理】
PCR技术原理
βEM
31M
IVS-I-1M
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-32M -29M -30M 14-15M CAP
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杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
βIVS-II-654/ βN标本
41-42N 654N -28N
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶 （如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的 与模板DNA链互补的链。
重复循环变性--退火--延伸三过程,每一次循环使反 应体系中的DNA分子数增加约一倍,而且这种新DNA分 子又可成为下次循环的模板。理论上循环n次，就增 加2n倍，即DNA分子数呈指数式增加。当经30次循环后， DNA产量达230拷贝，约为109拷贝。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几 百万倍。
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增（采用试剂盒） ： 反应液管（做好记号）
5000rpm，2秒
总体积25微升
加入 2ul DNA溶液
反应体系各组分的用量见理论课内容
PCR扩增条件
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
15min 10min 1min 30sec 30se/βN标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
31N 31M IntM
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
β-28/ β-28标本
广泛应用于基因突变检测（如地中海贫血、 G6PD缺乏症、耳聋等遗传病的检测）、基因分 型、遗传多态性检测以及病原体检测等多个方 面，具有广泛的临床应用价值。
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
31N 31M IntM
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
βCD17/ βN标本
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
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IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
β CD41-42/ βN标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
βCD17/ βIVS-II-654标本
蓝色斑点为阳性杂交信号，因此
N (+) M (-)
该位点无突变
N (+) M (+)
该位点杂合突变
N (-) M (+)
该位点纯合突变
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
PCR-反向点杂交应用
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。