β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)

反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶 （如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的 与模板DNA链互补的链。
重复循环变性--退火--延伸三过程,每一次循环使反 应体系中的DNA分子数增加约一倍,而且这种新DNA分 子又可成为下次循环的模板。理论上循环n次，就增 加2n倍，即DNA分子数呈指数式增加。当经30次循环后， DNA产量达230拷贝，约为109拷贝。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几 百万倍。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
βCD17/ βIVS-II-654标本
蓝色斑点为阳性杂交信号，因此
N (+) M (-)
该位点无突变
N (+) M (+)
该位点杂合突变
N (-) M (+)
该位点纯合突变
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
PCR-反向点杂交应用
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
βIVS-II-654/ βN标本
41-42N 654N -28N
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
31N 31M IntM
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
βCD17/ βN标本
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
β CD41-42/ βN标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-wk.baidu.com2M 17M
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管 B液 40ml
42 ℃预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
42 ℃洗涤15min
广泛应用于基因突变检测（如地中海贫血、 G6PD缺乏症、耳聋等遗传病的检测）、基因分 型、遗传多态性检测以及病原体检测等多个方 面，具有广泛的临床应用价值。
IntM
IVS-I-5M
β-28/βN标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
31N 31M IntM
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
β-28/ β-28标本
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增（采用试剂盒） ： 反应液管（做好记号）
5000rpm，2秒
总体积25微升
加入 2ul DNA溶液
反应体系各组分的用量见理论课内容
PCR扩增条件
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
【原理】
PCR技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链， 在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复 制成同样的两分子挎贝。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其 特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
【原理】
PCR技术原理