活体成像发光技术1

活体成像发光技术
基本原理
活体动物成像技术的基本原理是透过体 表, 接收动物体内物质所发出的荧光或可 见光显像, 因此检测中需要对病灶部位 (或 药物) 进行造影标记。
分类
• 可见光成像 (optical imaging) • 核素成像（radio-nuclear imaging） • 核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI） 成像 • 超声（ultrasound）成像 • 计算机断层摄影（computed tomography ，CT） 成像
• 特异性强，无自发荧光 生物发光方法是以酶和底物的特异作用而发光，特异性 极强。动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低 的背景，极高的信噪比。但用荧光方法时，在受到激发光 激发时，生物体中皮肤、毛发和各种组织及食物等都会产 生荧光，特别是被标记的靶点深臧于组织内部，需要较高 能量的激发光时，也就会产生很强的背景噪音。虽然荧光 信号强度远远超过生物发光，但极低的自发光水平使得生 物发光的信噪比远高于荧光。
活体成像 • 麻醉实验动物 • 注射底物荧光素。最佳的检测时间是在注射后15到35分钟之 间。(对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致， 最好先进行预实验确定何时发光信号最强。) • 成像，检测时间一般是1分钟到5分钟，如果信号特别弱，也 可以延长到10分钟，如果信号特别强，也可在1分钟以内。 对于荧光来说，检测时间是1秒以内。为节约时间，检测生物 发光，最多可同时检测5只小鼠。
技术应用
1.肿瘤学
活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿 瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是 极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统 方法的灵敏度大大提高了； 非常适合于肿瘤体内生长的定量分析； 避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。 由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研 究得到发展。建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移 的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿 瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理
步骤
细胞标记或动物标记 进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用 荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载 体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶 基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进 行。
体外预实验检测 • 需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成 像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功， 荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳 性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。 • 体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可 缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转 染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高 且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的 细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活 细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光 检测仪检测细胞裂解液的发光强度。 • 当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地 捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。（微孔板式 化学发光检测仪，如Berthold Centro LB 960）
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3．基因治疗 4．干细胞及免疫学 5．基因表达模式与基因功能研究 6．蛋白质相互作用 7．细胞凋亡
• 检测的深度 由于生物发光的灵敏度高于荧光成像，对于需要深部成 像的研究（检测的深度在3~4cm），如干细胞、原位肿 瘤与转移，自发肿瘤等，应用生物发光成像是最， 因为荧光素酶基因是插入细胞染色体中稳定表达 的，单位细胞的发光数量很稳定。即便标记细胞在动物 体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得 出发光细胞的相对数量。而对于荧光，激发光需要穿过 组织到达靶点，发射光需要从体内出来，路径较长。信 号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的 深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得 荧光强度较难定量。
1.生物发光（bioluminescence）-用荧光素酶 (Luciferase)基因标记细胞或DNA 2.荧光染料标记（fluorescence）-用荧光报告基团（GFP、 RFP, Cyt及dyes等）进行标记
生物发光（bioluminescence）的基本 原理
哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以 表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素 (luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶与其小分子 底物荧光素在氧、Mg2+存在的条件下消耗 ATP 发生氧化还原 反应, 将部分化学能转化为可见光能释放。因此只有在活细胞内 才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关
2.药物研究
• 在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效 跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞 的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断 途径。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时， 用该技术已经可以检测到很强的信号。由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细 胞。而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更 灵敏的发现药物的疗效。 利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤 接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给 药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。 在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因 表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。 在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物 载体的靶向脏器与体内分布规律（图11-2）。在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用， 观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路
生物发光及荧光特点的比较
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生物发光 优点 1.高灵敏度 （105vs102） 2.检测深度高 3.可进行经确定量 4.特异性强，无需激发光； 对 环境变化反应迅速，图像清楚； 信噪比较低 多种蛋白及染料可用于多重标 记，标记相对简单， 无需底物，价廉 活体动物、动物尸体、器官全 部可以进行成像 缺点 信号较弱，成像速度慢， 需要注入荧光素，仪器精 密度要求高 有些物质不能用生物发光 标记，如抗体、多肽等 很难用于人体 非特异性荧光限制了灵敏 度 信噪比高 不能精确定量
生物发光与其他体内成像技术的比较
优点 缺点 适用于小动物的研究， 无法标记小分子药物，暂不适用 灵敏度高，特异性好， 于人类和临床(正在研究中)， 操作简单，无放射性
生物发光
其他体内成 像技术 （PET,CT,M RI）
分辨率高，不需标记 适用于小分子药物标 记
特异性差，在肿瘤很小时无法区 分肿瘤细胞和正常细胞，并且对 于肿瘤细胞的活跃程度不敏感 小动物CT需要对动物有较强的X射线照射，容易引起突变，对动 物的生理有一定影响
荧光
高灵敏度——生物体内很多物质在受到激发光激发 后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到 检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部， 则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背 景噪音。荧光成像的灵敏度最高也只能在动物体内 检测到约105细胞，相对于生物发光在动物体内监测 到102数量级细胞的灵敏度要相差很多。