活体生物发光成像技术
小动物活体成像技术原理及常见问题分析
小动物活体成像技术原理及常见问题分析活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。
与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。
目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。
其中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。
LUC荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。
萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。
萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。
将萤火虫荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
GFP绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。
将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
小动物活体成像技术的原理及操作方法
⼩动物活体成像技术的原理及操作⽅法2、⽣物发光成像活体⽣物荧光成像技术就是指在⼩的哺乳动物体内利⽤报告基因-荧光素酶基因表达所产⽣的荧光素酶蛋⽩与其⼩分⼦底物荧光素在氧、Mg2+离⼦存在的条件下消耗ATP发⽣氧化反应,将部分化学能转变为可见光能释放。
然后在体外利⽤敏感的CCD设备形成图像。
荧光素酶基因可以被插⼊多种基因的启动⼦,成为某种基因的报告基因,通过监测报告基因从⽽实现对⽬标基因的监测。
⽣物荧光实质就是⼀种化学荧光,萤⽕⾍荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长⼴泛的可见光光⼦,其平均波长为560 nm(460—630 nm),这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。
在哺乳动物体内⾎红蛋⽩就是吸收可见光的主要成分,能吸收中蓝绿光波段的⼤部分可见光;⽔与脂质主要吸收红外线,但其均对波长为590—800 nm的红光⾄近红外线吸收能⼒较差,因此波长超过6 00 nm的红光虽然有部分散射消耗但⼤部分可以穿透哺乳动物组织被⾼灵敏的CCD检测到。
⽣物发光成像的优点可以⾮侵⼊性,实时连续动态监测体内的各种⽣物学过程,从⽽可以减少实验动物数量,及降低个体间差异的影响;由于背景噪声低,所以具有较⾼的敏感性;不需要外源性激发光,避免对体内正常细胞造成损伤,有利于长期观察;此外还有⽆放射性等其她优点。
然⽽⽣物发光也有⾃⾝的不⾜之处:例如波长依赖性的组织穿透能⼒,光在哺乳动物组织内传播时会被散射与吸收,光⼦遇到细胞膜与细胞质时会发⽣折射,⽽且不同类型的细胞与组织吸收光⼦的特性也不尽相同,其中⾎红蛋⽩就是吸收光⼦的主要物质;由于就是在体外检测体内发出的信号,因⽽受到体内发光源位置及深度影响;另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物,且底物在体内的分布与药动⼒学也会影响信号的产⽣;由于荧光素酶催化的⽣化反应需要氧⽓、镁离⼦及ATP等物质的参与,受到体内环境状态的影响。
⼆、⼩动物活体成像1、制作动物模型可根据实验需要通过尾静脉注射、⽪下移植、原位移植等⽅法接种已标记的细胞或组织。
小动物活体荧光成像生物发光实验步骤
小动物活体荧光成像生物发光实验步骤随着生物学技术的不断发展，活体荧光成像技术已经成为了研究生物体内生物学过程的重要手段之一。
通过活体荧光成像技术，研究人员可以实时观察到小动物体内的生物发光信号，揭示生物体内的分子过程和疾病发生的机制。
以下是一般小动物活体荧光成像生物发光实验的步骤，供感兴趣的研究人员参考。
实验材料准备1. 小动物：选择适合的实验小动物，例如小鼠或斑马鱼等。
2. 荧光成像仪：选择适合的活体荧光成像仪器，以保证实验成像的清晰度和准确性。
3. 示踪剂：根据实验需要选择合适的荧光示踪剂，例如荧光蛋白或荧光染料等。
4. 外源激发源：准备合适的外源激发源，用于激发小动物体内的荧光信号。
实验操作步骤1. 实验前准备：将实验用小动物按照规定的操作流程进行麻醉或固定，以保证实验操作的安全性和准确性。
2. 示踪剂注射：根据实验设计，将选定的荧光示踪剂通过适当的途径注入小动物体内，可以是静脉注射、腹腔注射等。
3. 示踪剂激发：在示踪剂注射后，根据实验需要，使用外源激发源对小动物体内的荧光示踪剂进行激发，激发的光源要根据示踪剂的激发波长进行选择。
4. 荧光成像：使用荧光成像仪器对小动物体内的荧光信号进行实时观测和成像，在观测过程中要注意调节成像仪器的参数，以保证成像的清晰度和信号的准确性。
5. 数据分析：实时观测并记录荧光成像的数据，根据实验设计进行数据分析和结果统计，揭示小动物体内的生物发光信号的分布和强度变化。
注意事项1. 实验操作要严格按照规定的操作流程进行，确保实验的准确性和可重复性。
2. 在注射示踪剂和激发荧光信号的过程中，需要注意对小动物的生理状况和实验操作的影响，以减少对小动物的伤害和干扰。
3. 荧光成像过程中要注意对成像仪器的参数进行调节，以获得清晰准确的荧光信号成像数据。
4. 在数据分析过程中，要根据实验设计进行结果的统计和分析，确保实验结果的科学性和可信度。
5. 实验结束后要对小动物进行恢复和护理，确保小动物的健康和安全。
生物活体成像技术发展前景
生物活体成像技术发展前景随着科技的不断进步和生命科学领域的发展，生物活体成像技术在医学、生物学和药物研发等领域中发挥着越来越重要的作用。
该技术通过非侵入性或微创性手段，能够在活体内观察和记录生物体的结构、功能和分子过程，为疾病的早期诊断、治疗方案的制定和治疗效果的评估提供了有力的支持。
随着技术的不断创新和突破，未来生物活体成像技术有望在医学研究和临床应用中发挥更大的作用。
首先，生物活体成像技术发展前景在于早期癌症的诊断和治疗。
随着生物标记物的发现与应用，例如抗体、病毒载体和纳米颗粒等，生物活体成像技术可以实现对早期肿瘤细胞的高灵敏、高分辨率的检测。
通过利用纳米颗粒在生物体内的分布和反应，活体成像技术可以提供早期癌症的定位、病变范围的评估和分子水平的详细信息，为医生制定个性化的治疗方案提供依据。
其次，生物活体成像技术在神经科学研究方面具有巨大的潜力。
通过光学成像、核磁共振成像（MRI）和脑电图等技术的应用，生物活体成像技术可以观察和记录大脑结构、功能和代谢活动。
这对于研究认知过程、神经退行性疾病和精神疾病的发生机制具有重要意义。
未来，生物活体成像技术有望进一步发展，提高对脑部活动的监测精度，并实现对不同大脑区域和神经递质的高分辨率成像，为神经科学领域的研究提供更深入的了解和解释。
此外，生物活体成像技术对于药物研发、药效评估和临床试验的支持也非常重要。
在新药开发中，活体成像技术可以实时监测分子药物的分布、代谢和效应，评估药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）过程，进而优化药物结构和疗效。
同时，活体成像技术可以在动物模型中测试药物治疗的有效性和安全性，为临床前药物筛选和评估提供可靠的数据支持。
未来，随着生物活体成像技术的发展，预计会有更多新型成像探针被应用于药物研发、药效评估和临床试验中，加速药物研究的进展。
最后，生物活体成像技术的发展前景还与生物制造和组织工程领域的进展密切相关。
活体成像技术可以实时监测和评估生物材料和组织工程构建物在体内的生物相容性、功能表现和修复过程，并提供宝贵的信息用于优化和改进生物材料和组织工程构建物的设计。
神经科学研究中的活体成像技术
神经科学研究中的活体成像技术神经科学是研究神经系统的结构和功能，以及神经系统与行为之间的相互关系的学科。
近年来，随着科学技术的发展，活体成像技术在神经科学研究中发挥着重要的作用。
活体成像技术是指在活体动物体内观察和记录器官、细胞和分子的动态过程的技术手段。
在神经科学研究中，活体成像技术能够提供详细的关于神经系统结构和功能的信息，帮助科学家深入了解神经系统的工作原理。
下面将介绍几种常见的活体成像技术。
首先是光学成像技术，如荧光成像和双光子显微镜。
荧光成像技术利用标记的荧光物质来观察和记录细胞和分子的活动。
这种技术可以实时观察神经元的突触活动、脑内钙离子浓度的变化以及信号传递的过程，揭示神经系统的动态运作。
双光子显微镜则具有更高的空间分辨率和更大的透射深度，能够观察更深层次的神经元和突触活动。
其次是磁共振成像（MRI）技术。
MRI利用强大的磁场和无线电波来获取人体组织的详细图像。
在神经科学研究中，MRI可以用来观察大脑活动的时空特征、脑结构的变化以及神经系统中不同区域的连接方式。
通过MRI技术，科学家可以探索脑与行为之间的关系，进一步理解神经系统的功能。
另一种常见的活体成像技术是电生理记录。
这种技术通过记录神经元的电活动来观察和理解神经系统的功能。
单细胞记录可以记录单个神经元的活动，如静息状态、动作电位和突触传递等。
此外，电生理记录还可以用于观察神经回路的活动，揭示神经系统各个区域之间的相互作用和同步性。
此外，现代的基因工程技术也为神经科学研究提供了活体成像的工具。
例如，发光蛋白（如GFP）的基因工程技术可将其植入到特定的神经元或细胞中，使其在特定条件下发出荧光信号。
这种技术可以实时观察和记录特定细胞类型的活动，并帮助科学家研究神经元的连接和功能。
活体成像技术的发展使神经科学研究取得了巨大的进展。
通过这些技术，我们能够更加深入地了解神经系统在正常和病态条件下的运作方式。
这对于理解和治疗神经系统疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病等，具有重要的意义。
活体生物发光成像技术原理及应用
活体生物发光成像技术原理及应用展开全文一、技术原理1. 标记原理哺乳动物生物发光，一般是将 Firefly luciferase 基因（由 554 个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体 DNA 上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。
将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。
这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
除Firefly Luciferase 外，有时也会用到Renilla Luciferase。
二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。
二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm 左右。
前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用 Firefly Luciferase 作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。
荧光素在氧气、ATP 存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素 (oxyluciferin)，并产生发光现象。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE 或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。
利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
2. 底物荧光素的特点荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：① 荧光素不会影响动物的正常生理功能。
活体成像系统
活体成像系统（in vivo imaging system）主要采用生物发光（bioluminescence）和（fluorescence）两种技术在活体动物内进行生物标记，通过成像系统来检测被标记的动物体内分子和或细胞的生物发展进程，并进行相关的生物、药物治疗研究，在体外检测、干细胞研究、纳米药物的传输等方面有着广泛的应用。
1.利用活体成像系统标记、示踪干细胞活体成像实验中常用萤火虫荧光素酶或亲脂性荧光素染料直接标记干细胞，从而监测干细胞在活体动物内的移植、存活、增殖；示踪干细胞在体内的分布于迁移；诱导多能干细胞在移植鼠体内的分化存活及免疫排斥。
利用生物发光和荧光不但可以监测到活体内细胞增殖，还可监测凋亡细胞事件，标记凋亡细胞可用于包括AIDS、神经退行性疾病、脊髓炎综合征、缺血／再灌注损伤及肿瘤等细胞增殖一调亡的平衡被破坏而发生的一系列相关疾病的研究。
2.利用活体成像系统进行纳米诊断癌症早期精准检测诊断对其治疗具有重要的意义，肿瘤标志物的传统检测方法存在敏感性与特异性方面的问题。
对于早期诊断来说，诊断灵敏度是其中至关重要的因素。
利用纳米粒子的独特的光、电、热、磁和力学性能，可以显著增强检测的灵敏度与特异性。
目前，基于纳米粒子的肿瘤疾病诊断技术主要包括早期肿瘤标志物检测技术、活体动态多模式影像诊断技术等。
例如，将能够识别肿瘤细胞表面受体的特异性配体与纳米粒子结合，待纳米粒子与肿瘤细胞特异性结合后，利用物理方法如测试传感器中的磁讯号、光讯号等，通过成像系统显影，能够对体内是否存在恶性肿瘤进行早期诊断。
除了诊断功能外，利用纳米诊断材料与肿瘤细胞结合的特性，进行肿瘤细胞示踪与捕获杀灭，实现诊断-治疗一体化是肿瘤纳米诊断治疗技术的重要目标。
3.利用活体成像系统检查标记的肿瘤细胞或抗肿瘤药物在肿瘤研究中，活体成像技术被用来检测肿瘤的生长，从而对基因治疗和抗癌药物的药效的进行评价，此外还应用于多种癌症，如肺癌、乳腺癌、膀胱癌等的活体动物模型的建立。
生物活体成像的技术与进展
生物活体成像的技术与进展生物活体成像技术是指利用现代生物医学技术和成像技术对活体生物的内部结构、生理功能进行观察和研究的方法。
随着生物医学科学的发展和技术进步，生物活体成像技术成为诊断、治疗和监测疾病的重要工具之一，同时也为科学研究提供了更加准确、直观、深入的手段。
本文将介绍生物活体成像技术的类型、原理及其在不同领域的应用。
一、生物活体成像技术的类型生物活体成像技术主要分为以下几类：1、放射性活体成像技术：包括正电子发射断层成像（PET）、单光子发射计算机体层成像（SPECT）等，是利用放射性同位素标记的生物分子对活体进行成像。
2、光学活体成像技术：包括蛋白质荧光标记和近红外荧光成像两种方式，可以对活体内部结构和生理功能进行高分辨率成像。
3、磁共振活体成像技术：包括磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS）等，可以对活体内部结构、代谢变化等进行成像和分析。
4、超声活体成像技术：包括超声成像（US）和超声弹性成像（USE）等，是利用超声波对活体进行成像和研究。
二、生物活体成像技术的原理不同类型的生物活体成像技术有不同的原理和方法。
放射性活体成像技术是通过标记放射性同位素，利用该同位素自发放射引发的能量释放和衰变所产生的射线对活体进行成像。
蛋白质荧光标记和近红外荧光成像的原理是将荧光蛋白或其他特定分子标记到感兴趣的生物组织和器官中，然后利用特定的激发光波长激发该荧光物质，得到荧光信号进行成像。
磁共振活体成像技术的原理是利用磁场和射频信号对活体进行成像。
超声活体成像技术则是利用超声波和声学窗口对活体进行成像和研究。
无论是哪种成像技术，其主要原理都是依据成像物质（如荧光物质、同位素、超声等）与活体本身的相互作用，通过不同的成像手段将失真性质的物理信号转化为可视化的图像。
三、生物活体成像技术的应用生物活体成像技术在生物医学研究中有着广泛的应用，以下分别从放射性活体成像、光学活体成像、磁共振活体成像和超声活体成像四个方面介绍其应用样例。
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实验过程
结果1 结果1：裸鼠皮下移植瘤模型的建立
5
实验过程
结果2 SCID鼠静脉移植瘤模型的建立 结果2：SCID鼠静脉移植瘤模型的建立
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实验过程
结果3 A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 结果3： A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 移能力的病理形态学观察
皮下瘤HE(20× 皮下瘤HE(20×) HE(20
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光学原理
实验过程
构建单克隆细胞株A549构建单克隆细胞株A549-luc A549
Pgl4.17[luc2/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549 Pgl4.17[luc2/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549 质粒转染人非小细胞肺癌细胞株 筛选抗性细胞及单克隆化 获得稳定表达荧光素酶的A549 luc细胞 A549获得稳定表达荧光素酶的A549-luc细胞
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实验过程
结果3 A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 结果3： A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 移能力的病理形态学观察
尾静脉接种模型脏器HE(20× 尾静脉接种模型脏器HE(20×) HE(20
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(A549/A549建立移植瘤模型 (A549/A549-luc)
裸鼠皮下移植瘤模型： 620± 裸鼠皮下移植瘤模型：nude mice, 6-7 w, 20±2 g, female; i.p. 105×106 /200 µl PBS; n=3; 150 µl /只(30 mg/ml), i.p., 10l l 后活体成像;QWK, w。 25 min 后活体成像;QWK, 4 w。 SCID鼠尾静脉移植瘤模型 鼠尾静脉移植瘤模型： 620± SCID鼠尾静脉移植瘤模型：SCID mice, 6-7 w, 20±2 g, female.; 5×106 /200 µlPBS; n=3; 150 µl /只(30 mg/ml), 5× lPBS; l lPBS i.p., 10-25 min 后活体成像;Q3D, 4 w。 后活体成像;Q3D, w。 i.p. 10原位成瘤及转移观察： 原位成瘤i.v. euthanized collected tumor on D26; i.v. mice will be euthanized and collected lung, brain, heart, liver and ovaries on D30. HE 4 staining.
活体生物发光成像技术
——A549-luc小鼠肺癌移植瘤模型 ——A549-luc小鼠肺癌移植瘤模型 A549
武 烨
2011.06.16
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活体生物发光成像技术 (Optical in vivo Imaging)
生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence); 生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence); (bioluminescence)与荧光 荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA; 荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA; 荧光报告集团(GFP, Cyt及dyes等 进行标记。 荧光报告集团(GFP, RFP, Cyt及dyes等)进行标记。 荧光照相机(charge 荧光照相机(charge coupled device camera, CCD camera) 及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(lsuciferae) 及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(lsuciferae)和 荧光素(luciferin)组成。 荧光素(luciferin)组成。 优点： 优点： • 无创性； 无创性； • 可多次重复在不同时间点检测； 可多次重复在不同时间点检测； • 快速扫描成像； 快速扫描成像； • 实验动物整体成像。 实验动物整体成像。
2
技术原理
标记原理
氧化反应：Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达 氧化反应：Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达 基因整合到细胞染色体DNA 荧光素酶， 外源（腹腔或静脉注射） 荧光素酶，当 外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧 光素(luciferin) 即可在几分钟内产生发光现象。 光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。 反应条件： 反应条件：ATP, O2。 光的强度与标记细胞的数目线性相关。 光的强度与标记细胞的数目线性相关。 分子生物学克隆技术：基因插入——单克隆细胞筛选— ——单克隆细胞筛选 分子生物学克隆技术：基因插入——单克隆细胞筛选— 稳定表达细胞株。 —稳定表达细胞株。 检测波长范围：400nm荧光 检测波长范围：400-950 nm荧光 最少可检测到皮下500 500个细胞 最少可检测到皮下500个细胞 相同深度检测到发光强度和细胞的数量有较好的线性 关系