液相色谱柱的选择
hplc色谱柱的选择
hplc色谱柱的选择
高效液相色谱（ HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的分离技术。
在（HPLC（分析中，色谱柱的选择是至关重要的，因为它直接影响分离效果和分析结果的准确性。
下面是一些选择（HPLC（色谱柱的要点：
1.（色谱柱类型：HPLC（色谱柱主要分为反相柱、正相柱和离子交换柱等类型。
根据待分析物的性质选择合适的色谱柱类型，例如，对于非极性化合物，通常选择反相柱；对于极性化合物，正相柱可能更合适。
2.（填料粒度：填料粒度越小，分离效率越高，但柱压也会相应增加。
一般来说，分析小分子化合物时选择细粒度填料，分析大分子化合物时选择粗粒度填料。
3.（柱子长度：柱子长度越长，分离效果越好，但分析时间也会延长。
根据分离要求和分析时间的限制选择合适的柱子长度。
4.（柱子内径：柱子内径越小，柱效越高，但柱压也会相应增加。
一般来说，分析小分子化合物时选择细内径柱子，分析大分子化合物时选择粗内径柱子。
5.（固定相：选择合适的固定相可以提高分离效果。
根据待分析物的性质选择合适的固定相，例如，对于非极性化合物，可以选择（C18（固
定相；对于极性化合物，可以选择硅胶固定相。
6.（品牌和价格：不同品牌的色谱柱质量和价格可能存在差异。
在选择色谱柱时，可以参考其他用户的评价和经验，选择性价比较高的产品。
在选择（HPLC（色谱柱时，需要综合考虑待分析物的性质、分离要求、分析时间和成本等因素。
如果对色谱柱的选择有疑问，可以咨询专业的色谱柱供应商或实验室技术人员。
液相色谱柱的选择与使用
液相色谱柱的选择与使用
目录 一、液相色谱柱的选择 1、 分离模式的选择 2、 C-18柱的性能影响因素 3、 保留值与pH的关系 二、液相色谱柱的安装 1 、液相色谱柱的结构 2、 色谱柱的安装 三、液相色谱柱的使用 1 、样品的前处理 2 、流动相的配制 3、 色谱柱的平衡 4、 流动相流速的选择 四、 分析条件调整的影响 五、液相色谱柱的维护
• 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位.
保留值与pH的关系
pH变化： 0.2个pH(7.0~7.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.6~14.8分钟)
保留时间随pH 改变不明显
保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中)
保留时间
保留值与pH的关系
•碳覆盖率 •封端
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
C-18柱的性能影响因素：色谱柱物理性质
硅胶纯度 • 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸 • 填料床的长度和内径
颗粒形状 • 球型或不规则型
粒径 • 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积 • 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
封端 • 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键
合后封闭起来
C-18柱的性能影响因素：键合类型
CH3
键合类型对色谱分离的影响 ： O Si
单齿键合：
CH3
OSi
CH3
提高传质速率, 加快色谱柱平衡
O Si CH3
CH3
OSi
CH 3
双齿键合：
O Si
增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载
液相层析法中色谱柱选择与操作技巧
液相层析法中色谱柱选择与操作技巧液相层析法（Liquid Chromatography，LC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
在液相层析实验中，选择合适的色谱柱和掌握操作技巧是非常重要的，本文将探讨液相层析法中色谱柱选择与操作技巧的相关内容。
一、色谱柱的选择1. 相性选择在选择色谱柱时，相性是首要考虑因素之一。
色谱柱的相性应与待分离的化合物相匹配，以保证分离效果。
对于极性化合物，可以选择正相色谱柱，如C18柱；对于非极性化合物，可以选择反相色谱柱，如C8柱。
此外，还有其他特殊相性的色谱柱，如糖酒石酸柱、氨基酸柱等，可以根据需要进行选择。
2. 尺寸选择色谱柱的尺寸也是需要考虑的因素之一。
常见的色谱柱直径有2.1 mm、4.6mm等，长度一般为150-250 mm。
选择合适的柱尺寸可以提高分离效果和样品通量，同时也会影响分离时间和分辨率。
对于复杂的样品，可以选择细柱，如2.1mm×50 mm，以提高峰形和分辨率；对于样品量较大的情况，可以选择大柱径，如4.6 mm×250 mm，以增加样品通量。
3. 粒径选择色谱柱的粒径也是一个重要的选择因素。
粒径是指填充在柱中的固定相颗粒的直径，常见的有3 μm、5 μm、10 μm等。
粒径越小，表面积越大，分离效果越好，但也会带来较高的压力和较长的分离时间。
一般而言，对于常见的分析要求，5μm的粒径已足够满足分离要求；对于更高的分离要求，可以选择更小的粒径。
需要注意的是，选择不同粒径的柱时，需调整相应的操作参数，以保证分离效果。
二、色谱柱的操作技巧1. 前处理样品在液相层析实验中，样品前处理是一个非常关键的步骤。
样品中的杂质和干扰物会对分离效果产生不利影响，因此需要进行适当的前处理。
常见的前处理方法包括：固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）、液液萃取等。
前处理的目的是提取和富集分析物或去除干扰物，以提高检测灵敏度和分离效果。
常用液相色谱柱型号及适用范围
常用液相色谱柱型号及适用范围
液相色谱柱是一种常用的色谱分析仪器，常用的液相色谱柱型号及适用范围如下：
- 反相色谱柱（Reverse Phase Column）：由高吸附性的非极性填料填充，用于对极性化合物的分离，常见的填充物包括C18，C8，C4和CN等，反相色谱柱广泛应用于药物分析，天然产物分离等领域。
- 手性色谱柱（Chiral Column）：适用于分离具有手性结构的化合物，如药物、农药、食品添加剂等，常见的手性色谱柱包括手性固定相色谱柱和手性流动相色谱柱。
- 离子交换色谱柱（Ion Exchange Column）：由离子交换树脂填充而成，能够分离带电荷的化合物，如阴阳离子、蛋白质、多肽等，常用于环境分析、食品分析、药物分析等领域。
- 尺寸排阻色谱柱（Size Exclusion Column）：由多孔性填料填充而成，能够分离分子大小不同的化合物，如蛋白质、多糖、聚合物等，常用于生物大分子的分离和分析。
不同型号的液相色谱柱适用范围不同，在选择液相色谱柱时，需要根据待测化合物的性质和色谱分析的要求选择合适的色谱柱。
怎样选择合适的液相色谱柱
HPLC色谱柱一、色谱分离模式——正相、反相、离子交换、离子抑制、亲水作用正相色谱是色谱的经典形式，使用极性固定相和非极性流动相。
洗脱物通过其极性基团和固定相上的极性基团作用被保留。
这种应用，经典的是使用未键合的硅胶和氧化铝，但现在使用的极性键合相有以下优点：键合相平衡快，对流动相中微量的水不敏感，和产生不同的选择性。
二醇基键合相比纯硅胶极性小，平衡速度快；氰基键合相是保留能力最小的正相吸附剂；氨基键合相适宜分离芳香族碳氢化合物反相色谱已成为最流行的色谱分离模式。
反相色谱中，固定相非极性，流动相极性。
典型的流动相一般是水或水系缓冲液与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合物。
典型的固定相是用脂肪烃硅完化的硅胶键合相，其它用于反相色谱的基质有石墨化碳和苯乙烯-二乙烯苯基质。
反相色谱的性能还受残留的硅醇基的活性的影响。
硅醇基与洗脱物的极性基团作用。
因此，根据硅醇基的活性不同，填料显示出不同的选择性。
而且，常能观察到碱性物质在硅醇基活性高的填料上产生拖尾峰。
修饰硅醇基活性的一个办法是封端，即用硅烷化试剂把硅醇基转变成三甲基甲硅烷基基团。
不过，即使是作了封端，基质表面的硅醇基密度还是比键合配基的密度大。
硅醇基的活性也和硅胶的预处理（基质灭活）、硅胶纯度有关。
碱性分析物的色谱分析推荐使用高纯度硅胶基质、充分封端的键合相。
未封端的填料在许多应用中有可以获得不同选择性的优点。
使用带有离子电荷的固定相，使根据洗脱物电荷进行分离成为可能。
对于硅胶基质的离子交换填料，离子基团通过标准的硅烷化技术键合到硅胶表面。
对于聚合物基质的离子交换填料，离子交换基团分布于交联聚合物的整体（through the matrix）。
有四种离子交换填料：强/弱阳离子交换填料和强/弱离子交换填料。
弱离子交换填料的特征是电量与pH值有函数关系。
以羧酸基为功能基的离子交换剂是弱阳离子交换剂的代表。
弱阴离子交换剂由一级、二级、三级铵为功能基。
大部分强离子交换剂的电荷与pH值无关。
常用液相色谱柱选择
常用色谱柱简介气相色谱毛细柱（键合，聚二甲基硅氧烷）HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB，Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用温度：-60℃-320℃应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱醇，香料，咖啡，食品添加剂等。
(键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷)对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷）应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB，油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5镇痛药，除草剂等。
类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度：-60℃-320℃PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷)酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5，苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525，生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625）生物碱，防腐剂，香料等。
类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。
(键合,聚乙二醇二万)对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱HP-INNO Wax,AT-Wax(键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷)类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃BP-10，CPSil19CB应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚，类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代℃烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，应用范围：醇，卤素化合物，有机氯农药，酸性药苯乙烯，茶，溶剂等。
正确选购色谱柱需要注意哪些方便
正确选购色谱柱需要注意哪些方便色谱柱是气相色谱、液相色谱等分析仪器的核心部件，其性能直接影响到分析结果的准确性和可靠性。
因此，在选购色谱柱时，需要关注以下几个方面的注意事项：1、确定分析目的和样品类型首先，需要明确分析的目的和样品类型，以便选择合适的色谱柱。
例如，假如需要进行环境监测、食品安全、药物分析等领域的分析，可以选择相应的专用色谱柱；假如需要进行石油、化工、制药等行业的分析，可以选择相应的行业专用色谱柱。
2、选择合适的固定相固定相是色谱柱的核心部分，其性能直接影响到色谱柱的分别效果和稳定性。
常见的固定相有硅胶、氧化铝、聚合物等。
硅胶固定相具有较好的耐高温性和化学稳定性，适用于各种类型的样品分析；氧化铝固定相具有较高的选择性和分别度，适用于多而杂样品的分析；聚合物固定相具有良好的亲水性和选择性，适用于生物样品、食品等亲水性样品的分析。
3、选择合适的柱尺寸和内径色谱柱的尺寸和内径直接影响到色谱柱的分别效果和分析速度。
一般来说，柱尺寸越大，分别效果越好，但分析时间越长；柱内径越小，分别效果越好，但分析时间越长。
因此，需要依据实际需求选择合适的柱尺寸和内径。
4、选择合适的柱温柱温对色谱柱的分别效果和分析速度有很大影响。
一般来说，柱温越高，分别效果越好，但分析时间越长；柱温越低，分别效果越差，但分析时间越短。
因此，需要依据实际需求选择合适的柱温。
同时，还需要考虑色谱柱的热稳定性，以确保在高温下仍能保持良好的分别效果。
5、选择合适的流动相流动相是推动样品在色谱柱中移动的动力，其性能直接影响到色谱柱的分别效果和分析速度。
常见的流动相应有甲醇、乙腈、水等。
在选择流动相时，需要考虑其与固定相的兼容性、极性、粘度等因素，以确保在实际应用中能够获得良好的分别效果。
6、考虑色谱柱的品牌和价格市场上有很多不同品牌和型号的色谱柱，价格差别较大。
在选择色谱柱时，需要综合考虑品牌、价格、性能等因素，选择性价比较高的产品。
液相工作中的色谱柱选择
mAU
20
As 1.15
与其它C18s色谱柱保留相近
2 .0 2.5 M in u t e s 3 .0 3.5 4 .0 4.5 5 .0
10
0 0 .0 0.5 1 .0 1.5
40
Gemini C18
更好的对称性
所有色谱柱 150 x 4.6mm, 5µm 流动相: H2O/MeCN, 60/40 流速: 1.0mL/min 柱温: 25°C 检测器: UV@ 254nm 进样量: 5L 目标物: 1. 吡啶 2. 苯酚
• 工作类型
• 常规检测 • 新方法开发
• 仪器类型
• 色谱 • 色谱质谱 谱 谱
5
常规检测的色谱柱选择
——与柱效、分离度有关的关键色谱柱参数
常见问题
7
原因分析
• 表面含有大量硅醇基 • 金属离子含量高 • 通常没有封端
Si-OH -- X
•碱性化合物 Si-OH -- NH2-R（氢键） Si-O---+NH3-R （离子交换 离子交换 ） •酸性化合物 Si-OH Si OH -- O O=RCOH RCOH
5.0
ZORBAX Eclipse Plus C18
30 mAU 20
As 1.21
ห้องสมุดไป่ตู้10
0 0.0 0.5 1 .0 1 .5 2.0 2.5 M in u t e s 3 .0 3 .5 4.0 4.5 5 .0
11
常见问题
12
原因分析
柱 柱效
去甲替林 普萘洛尔 萘磺酸
质量过载(0.1~5μg)
液相工作中的色谱柱选择
2014 年 4 月
Thermo Scientific 色谱柱系列概览
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1．柱子的PH值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。
（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。
如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。
最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45 µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三．色谱柱的维护1. 色谱柱的平衡反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。
新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。
请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。
每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。
2．色谱柱的再生长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。
可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。
建议用来冲洗柱子的溶剂体积色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积125-4mm 1.6ml 30ml250-4 mm 3.2ml 60ml250-10mm 20ml 400ml选择再生方法：极性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水注意：a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
3. 色谱柱的维护a．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围c．避免流动相组成及极性的剧烈变化d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
怎样选择色谱柱现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填的选择。
但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。
一. 硅胶基质填料1·正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其他具有极性官能团胺基团，如(NH2，APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。
由于硅胶表面的硅轻基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如:正己烷(Hexane)、氯仿(Choroform)、二氯甲烷(Methylene Cloride)等。
2，反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲掖与甲醇、乙情等的混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反相填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H，(Phenyl)等。
二·聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸醋等，其主要优点是在pH值为1一14均可使用。
相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。
现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
三、其它无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。
如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。
这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。
该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。
石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。
氧化铝也可以用于HPLC。
氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。
但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。
新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。
商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。
由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。
怎样选择填料粒度目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。
填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。
粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。
在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。
如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。
3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。
与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。
另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。