测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析
• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高 压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快， 但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下， 电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但 对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基， 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动，形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液， 蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增 加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后， 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血 清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量
lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的 洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积， Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质 量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是300080000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为 6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。
计算
分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线 法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质 量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数 (logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样 品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质 量。
注意事项
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量
1
实验目的
掌握凝胶层析的基本原理。 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质
量的实验技能。
实验原理
凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具 有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层 析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析 柱时，其中各组分按其分子大小不同而被 分离的技术。该法设备简单、操作方便、 重复性好、样实验成败的关键之一，若样品稀释 或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。 上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出 口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关 闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算 流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时 关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱 液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上， 使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进 水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床 容积的1—2%；制备用量为柱床容积的 20%~30%。
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法
蛋白质相对分子质量可用以下几种常见的实验测定：
1.同位素掺入法：能准确测定蛋白质相对分子质量的一种方法，它的原理是利用质谱方法，将蛋白质样品中的氢原子替换成同位素氢，如²H 或³⁷Cl，用质谱分析同位素掺入后的蛋白质的改变，从而推算出蛋白质的相对分子质量。
2.SDS-PAGE：蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中移动的速度与分子质量有关，可用此方法推算蛋白质的相对分子质量：根据蛋白质在凝胶上移动的时间确定其相对分子质量。
3. 光波谱法：可以通过紫外拉曼光谱（UV-Raman）或者红外谱（IR），计算结合能从而计算蛋白质分子的相对分子质量。
4.质谱分析法：利用质谱技术直接测定蛋白质的大小，包括电喷雾质谱（ESI-MS）、离子化质谱（FAIMS）和质谱分析（MS）等技术。
利用质谱技术，可以测定蛋白质的相对分子质量，从而帮助我们研究蛋白质的特性和作用。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中 的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时 换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种经常使用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合进程由自由基催化完成。
的经常使用方式有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以(TEMED)为加速剂。
在聚合进程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维。
PAGE依照其有无浓缩效应，分为持续系统和不持续系统两大类，持续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，要紧靠电荷和。
不持续系统中由于离子成份，pH，凝胶浓度及电位梯度的不持续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分离条带清楚度及分辨率均较前者佳。
不持续体系由电极缓冲液、浓缩胶及所组成。
浓缩胶是由AP 而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为Tris-HCl。
电极缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH 值使不持续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成份的不持续性，这是样品浓缩的要紧因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的断裂。
在和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，如此就排除不同分子间的电荷不同和结构不同。
SDS-PAGE一样采纳的是不持续缓冲系统，与持续缓冲系统相较，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，通过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭小的区带。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量试验报告
SD9 PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称 PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED 为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液 pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为的 Tris-HCl 。
分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为 Tris-HCl 。
电极缓冲液是 Tris- 甘氨酸缓冲液。
2 种孔径的凝胶、 2 种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAG一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
• 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种： • （1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂， 四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED 催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、 活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。 • （2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素 在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基 而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且 随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的 凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般 采用化学聚合。
四 电泳
• 将上槽接负极，下槽接正极，打开电源， 开始时将电流控制在15～20 mA,待样品进 入分离胶后，改为30～50 mA。待蓝色染 料迁移至下端约1～1.5 cm时，停止电泳， 约需1～2小时。
五 剥胶
取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白 瓷盘或大培养皿内，在染料区带的中心插 入细铜丝作为标志。
六 染色和脱色
染色 用一块胶，另一块胶用于转膜。 加入染色液，染色45分钟。 脱色 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。 20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步 观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景 清晰。
七 Mr的计算
• 通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁 移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带 中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算： • 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)／染料 迁移距离(cm)。 • 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率 作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移 率，从标准曲线上查出其相对分子质量
牛血清 样品2 样品1 蛋白 样品1 marker 样品2 牛血清
第一组加样
第二组加样
第二块胶加样顺序与第一块胶相同
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。