《支原体清除试剂》使用说明书
支原体指导书
文件名称微生物标准染色方法版本文件编号状态编写日期编写审核日期审核发布日期签字【检验目的】检验样本中是否含有抗酸杆菌，为临床提供诊断依据。
【原理】结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。
利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色）。
【试剂】试剂名称：结核菌染色液试剂生产厂家：珠海贝索生物技术有限公司包装规格：250ml*4试剂组成：1、石碳酸复红溶液2、酸性酒精溶液3、亚甲基蓝溶液储存条件及有效期：原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。
【标本要求】（1）标本类型：病人的痰、穿刺关节液、腹水、胸积液、组织、脑脊液、分泌物、尿液等。
（2）标本采集：见标本采集手册（一般须得深咳痰，其它无特殊要求。
）（3）标本储存和运输：可室温保存、室温运送。
病人标本须密封运送以避免污染环境。
【检验方法】1、痰液标本取干酪样、脓样或可疑部分约0.05毫升，其他体液标本取离心后沉淀0.05毫升，于玻片正面均匀涂抹成10*20毫米卵圆形菌膜，自然干燥。
染色前加热固定。
2、放置在染色架上，玻片间距保持10毫米以上距离；火焰固定。
3、滴加石碳酸复红溶液盖满玻片，染色10分钟或更久。
4、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
5、自菌膜上端外缘滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟；如有必要，需流水洗去酸性酒精溶液后，再次脱色至菌膜无可视红色为止。
6、流水自玻片一端轻缓冲洗10-20秒，冲去酸性酒精溶液，沥去玻片上剩余的水。
7、滴加亚甲基蓝溶液，染色30秒钟。
8、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去亚甲基蓝溶液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。
9、一张染色合格的玻片，菌膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块。
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
支原体 PCR 检测试剂盒使用说明书
支原体 PCR 检测试剂盒使用说明书Product Name: Mycoplasma PCR Detection KitIntended Use:The Mycoplasma PCR Detection Kit is intended for the qualitative detection of Mycoplasma spp. in cell cultures and other biological samples by PCR amplification.Kit Components:- PCR amplification reaction mix and enzyme mix- Positive control DNA template- Negative control DNA template- PCR tubes and caps- User manualStorage:The kit should be stored at -20°C. Thaw the kit components at room temperature before use.Sample Preparation:1. Collect the cell culture sample or other biological sample.2. Extract the DNA from the sample using a DNA extraction kit of your choice.3. Dilute the DNA extract as necessary in molecular grade water or buffer to achieve the optimal concentration for PCR amplification (typically between 10-100 ng/µL).PCR Amplification:1. Prepare the PCR reaction mix (in a sterile tube or plate) by adding the PCR amplification reaction mix, enzyme mix, andtemplate DNA to the appropriate volumes as specified in the table below.Component Volume per Reaction (20 µL)PCR amplification reaction mix 10 µLEnzyme mix 1 µLTemplate DNA 1-5 µLMolecular grade water/buffer To 20 µL2. Close the PCR tubes with the caps provided and mix the contents well by vortexing or pipetting.3. Place the tubes in a thermal cycler and perform PCR amplification according to the following conditions:Initial denaturation: 95°C for 5 minutesDenaturation: 95°C for 30 secondsAnnealing: 55°C for 30 secondsExtension: 72°C for 1 minuteFinal extension: 72°C for 5 minutesHold at 4°C4. Analyze the PCR products by gel electrophoresis or other methods as appropriate.Interpretation of Results:- Positive Result: A distinct band is observed in the gel at the expected size for Mycoplasma spp. This indicates the presence of Mycoplasma DNA in the sample.- Negative Result: No band or only faint bands are observed in thegel. This indicates the absence of Mycoplasma DNA in the sample. - Invalid Result: No bands or smear are observed in the gel or the band size is incorrect. Repeat the experiment with fresh controls and follow the instructions carefully.Limitations:1. This assay is designed for research use only and is not intended for diagnostic purposes.2. False negative results may occur due to low level or degraded Mycoplasma DNA in the sample, PCR inhibitors, or other factors.3. The presence of PCR inhibitors in the DNA extraction and amplification process may affect the sensitivity and reproducibility of the assay.4. The kit components must not be used beyond the expiry date.5. The Mycoplasma PCR Detection Kit may only be used by trained personnel.。
支原体污染的检测方法
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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电话：021-33921235 邮箱：bestbio@ 传真：021-60853530
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
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产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
支原体试检测剂盒使用说明书(中文版)
支原体检测试剂盒使用说明书1.试剂：支原体检测试剂盒由武汉源深生物科技有限公司提供。
2.实验方法:巢式PCR的方法检测支原体污染：A.待检细胞汇合率在90％以上时取100 µL细胞上清液到离心管内B.95o C孵育5分钟C.短暂高速离心15秒钟左右D.试剂盒里的组份：引物混合物(Primer Mix) 20 µL阳性对照DNA (Positive Control DNA) 15 µL阴性对照(Internal Control DNA) 20 µL巢式PCR一共需要做2轮PCR，本检测方法不受其他来源（如所培养细胞）DNA的影响，不但提高了检测的灵敏度，同时也提高了特异性。
(1)第一轮PCR:PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
E.热循环程序：将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序。
PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
F. 热循环程序：将准备好的PCR 管放入PCR 仪，运行如下程序。
试验结果：2％ 琼脂糖凝胶电泳，TBE 缓冲液，PCR 产物及Marker 均点样10µL ，于50V 下电泳1hr ，EB 染色15min ，紫外灯下观察。
电泳结果见下图：图中泳道M 为DNA Marker ，1和2为待检测细胞系的第一轮PCR 产物 (1st )，3和4为待检测细胞系的第二轮PCR 产物 (2nd ), 其中1、3为阳性对照管PCR 产物，2、4为阴性对照PCR 产物。
阳性对照管在200bp 左右，和300-400 bp 处各有一条带，证明本次实验准确可靠 (不同的支原体Mycoplasma, such as M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. arthritidis, M. hyopneumoniae and Acholeplasma laidlawii 的保守区的片段长度不一，大概在200-400 bp 之间)。
支原体检测说明书
SaveIt系列产品——支原体检测试剂盒说明书一、产品简介支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
针对细胞、培养基以及动物血清的支原体检测，我们推出了Myco-PCR-TEST快速支原体检测试剂盒。
本试剂盒基于PCR检测原理，根据支原体高度保守的16和23SrRNA区域设计的特异性引物，经过简单快速的PCR，从而迅速准确判断支原体污染是否被清除。
汉恒生物（）推出的SaveIt TM抗支原体试剂能够在不影响细胞状态的前提下能够有效的清除支原体污染，从而使一些珍贵的细胞受到支原体污染之后能够得到挽救。
二、产品包装产品规格见标签三、使用说明使用Trizol 法抽提待检测细胞的RNA，反转录为CDNA 后，加入支原体检测引物，进行PCR 检测细胞支原体污染情况。
四、操作步骤4.1样品处理1、A：培养贴壁细胞：不须胰酶消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。
B：悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
2、细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
3、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
4、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、4℃ 12,000g离心15min。
6、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
7、按0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min 。
支原体清除剂说明书
支原体清除剂说明书货号：CA1090规格：200μL保存：-20℃，一年（避免反复冻融，建议分装保存。
）注意：1.请在收到货后，将试剂管瞬时离心。
2.产品出现沉淀属正常现象，在分装或使用前须在室温下震荡溶解至澄清透明状，不影响产品的使用效果。
产品说明：支原体是一种大小仅为0.2~0.3μm，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22~0.45μm）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。
多篇文献研究表明：当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。
支原体清除剂用于解决因支原体污染而导致细胞污染或状态下降的问题，同时其对于常见的革兰氏阴性和阳性菌也有一定的清除作用，从而确保研究人员的研究结果真实、可信。
使用说明：1．建议现配现用，并保持细胞密度在50～60%。
2．推荐稀释比例为1:1000。
例如10mL的培养基加入10μL支原体清除剂混匀。
3．弃去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入含有支原体清除剂的新鲜培养基，1天1次，连续处理3天；或者2天1次，连续处理5～6天。
若细胞污染非常严重时，需延长处理时间。
4．若细胞对支原体清除剂敏感，或生长明显被抑制时，可调整稀释比例，如：1:2000或1:30005．处理完毕后，加入新鲜培养基，培养基中可添加支原体预防剂预防支原体再次污染。
6．因支原体清除剂本身具有广谱抑菌性，为了降低对细胞的影响，强烈建议不要和其它抗生素同时使用。
产品优势：1．特异性清除培养基中的支原体；2．只需要处理3天左右，便可以有效清除支原体；3．活性成分为多肽类，不会产生耐药性；4．对细胞几乎无毒性，在100多种细胞上进行过验证，包括但不限于HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；5．广谱性，可替代双抗，可以清除常见的革兰氏阴性和阳性菌；6．可直接加入血清、培养基中，用于清除支原体污染；。
NocardTreatment说明书
Nocard Treatment说明书（支原体清除剂）产品简介：Nocard Treatment是第三代支原体清除剂，主要用于清除细胞、血清、培养基中的支原体，同时对常见的细菌也有一定的清除作用。
新一代配方技术，只需3天就可以清除细胞内外的支原体。
主要成分为抗菌肽（AMPs）+穿膜肽（CPPs）。
作用原理Nocard Treatment中的AMPs可以有效杀灭细胞外面的支原体和常见细菌，而CPPs可以携带AMPs进入细胞，清除细胞体内的支原体，让细胞彻底摆脱支原体污染的困扰，确保研究人员实验结果的可信度。
产品规格：货号产品名称规格C8001 Nocard Treatment 200μLC8002 Nocard Treatment 200μL×5储存条件及有效期：4℃，6个月；-20℃，18个月。
使用说明：1. 请在收到货后，将试剂管瞬时离心（3000 rpm，3～5 s）后保存；2. 使用Nocard Treatment处理时，建议保持细胞密度在50～60%；3. 推荐Nocard Treatment的稀释比例为1:1000，例如：1 mL培养基加入1 μL的Nocard Treatment；4. 弃去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入新鲜的含有Nocard Treatment的培养基，1天1次，连续处理3-6天。
注意事项：1.分装储存，务必现配现用；2.因本品与抗生素有拮抗作用，因此不得与抗生素混用；3.若细胞污染非常严重，细胞状态不佳，建议以1:500的比例使用，并适当延长处理时间；4.因本产品属于蛋白类产品，若部分细胞对本产品敏感，建议使用本品处理2天，然后换用无本品的培养基处理1-2天，重复此步骤处理3-4个周期即可；5.本试剂仅供研究使用。
※注：Nocard Treatment能够清除大部分种类的支原体，而对细胞本身无毒，已经在上百种的细胞上做过验证，如：小鼠胚胎干细胞或iPS细胞、人胚胎干细胞或iPS细胞、HEK293、Hela、HepG2、HCT116、COS-7、Vero、Huh-7、MDCK、PANC-1、SW620、U2OS、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL60、K562、MDA-MB-231、SP20、T47D、BM 和BV2等。
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5) 以后每隔 1 个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。
注意事项
根据细胞污染情况，一个疗程是 7-15 天检测一次，如果检测之后发现没有支原体污染，还 建议试用对半浓度继续维持 15 天，最后撤掉。由于我们支原体清除试剂对细胞生长几乎没 影响，可以重复添加，对于实验室环境比较不受控的情况，建议重复添加以预防。
《支原体清除试剂》使用说明书
关于支原体
支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约 0.1 - 0.6 微米。目前， 已发现的支原体品种有 100 多种。 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的 0.20 微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过 0.10 微米孔径的除菌滤膜，造成细胞的 支原体污染。
科佰产品
货ห้องสมุดไป่ตู้ CBP50044
名称 支原体清除试剂（1000x）
规格 1ml
价格 900.00
货期 现货
产品用途
该产品专用于消除那些被支原体和某些无细胞壁的细菌感染的细胞系。在小型或大型 细胞培养中，也可以直接添加到液体培养基中来预防支原体及常见的细菌污染。该产品仅 用于基础研究，非临床用品。
运输和储存
细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最 主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培 养液等；
哺乳动物细胞的培养，支原体污染是个世界性的问题。目前，世界各国细胞系支原体 污染的平均比例为 30-60%，有些国家甚至高达 80-90%。支原体污染几乎可以改变细胞的 所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从 2013 年开始，《Nature》期刊已正 式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测，以保证所用的细胞没有支原体 污染。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
该产品在 2-8℃下运输，收到产品后请放于-20℃保存，该条件下，至少可以保存 2 年。推荐分装保存于-20℃。
使用方法
1) 从-20C 冰箱中取出支原体去除试剂，室温融化； 2) 将 50-100 万个细胞铺到 60 mm 的细胞培养皿内，加入 4 mL 含支原体清除试剂的正常
细胞培养液（按 1:1000 比例加入）； 3) 每 2-3 天更换细胞培养液，加入新鲜的含支原体清除试剂的正常细胞培养液。期间如