志贺毒性大肠杆菌 (STEC) 的临床实验室检验
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂 翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘 要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。
每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。
检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。
关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in BeefSamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin (Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。
志贺氏菌检验方法
志贺氏菌的感染途径
摄入感染
食用被志贺氏菌污染的食物或水是主要的感染途径。
接触感染
接触患者的排泄物、分泌物等，也可通过皮肤、黏膜等途径感染。
志贺氏菌的致病机理
侵袭作用
志贺氏菌通过侵袭肠黏膜细胞，破坏肠道屏障，引起肠道炎症和溃疡。
毒素作用
多重耐药性监测
建立和完善多重耐药性监测网络，实现对志贺氏菌多重耐药性的全面监测和 及时预警。
THANKS
06
志贺氏菌检验的未来发展趋势
新技术的开发和应用
01
基于纳米技术的检测方法
利用纳米材料和纳米技术的独特性质，实现对志贺氏菌的高灵敏度和
高特异性检测。
02
生物传感器技术
利用生物传感器技术，实现对志贺氏菌的实时监测和快速筛查，提高
检测速度和准确性。
03
免疫学检测方法
研究和发展新型的免疫学检测方法，提高检测的灵敏度和特异性，实
志贺氏菌可产生多种外毒素和内毒素，对肠道细胞和免疫系统产生毒性作用，导 致腹泻、发热等症状。
02
实验室检验方法
常规检验方法
1 2
粪便检查
适用于细菌性痢疾患者的粪便标本，采用粪便 直接涂片或培养进行分离鉴定。
肠内容物检查
采集患者直肠拭子或灌洗液，通过培养基培养 后分离志贺氏菌。
3
血清学检测
采集患者急性期和恢复期血清，采用凝集反应 、ELISA等方法检测抗体变化。
基因测序
对志贺氏菌的基因进行测序分析，用于研究菌种分型、耐药性等特征。
03
临床检验方法
常规检验
粪便外观检查
观察粪便中是否有红细胞、白细胞或其他异常细胞，以初步判断肠道是否有炎症 或感染。
免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌O157和志贺毒素
上海交通大学硕士学位论文免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌O157和志贺毒素姓名：高成秀申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：严亚贤;孙建和20080101免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌O157和志贺毒素摘要大肠杆菌O157是产志贺毒素大肠杆菌（Shiga-producing Escherichia coli, STEC）的主要血清型，可以引起人和动物的腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜。
志贺毒素（Shiga toxin，Stxs）是大肠杆菌 O157的主要毒力因子之一，有两个生物型：Stx1和Stx2，只产生Stx2的菌株毒力比只分泌Stx1和两者同时分泌的菌株毒力都强。
Stx2致病剂量极低，且分泌胞外，Stx2的检测将直接有助于对分离菌株致病力强弱的判定，提高对高致病性大肠杆菌O157菌株的检出。
因此本课题研究大肠杆菌O157和Stx2的胶体金层析法(Ｇｏｌｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｓｓａｙ， ＧＩＣＡ)，进行高致病性大肠杆菌O157菌株检测和鉴定，以便更好的预防和控制大肠杆菌O157所致的人和动物的疾病。
将本实验室构建的重组Stx2B亚单位的质粒pGEX-Stx2B转化入大肠杆菌BL21，然后采用PCR和酶切进行鉴定，将阳性转化菌进行重组蛋白的表达、鉴定、纯化，用纯化的融合蛋白多次免疫新西兰大白兔制备抗重组Stx2B的多克隆抗体。
同时用大肠杆菌O157 ATCC43889全菌体抗原多次免疫新西兰大白兔，制备抗大肠杆菌O157多克隆抗体。
用硫酸胺法、辛酸-硫酸胺法、Protein G亲和层析3种方法分别纯化制备的多克隆抗体，结果表明：Protein G法纯化的抗重组Stx2B IgG纯度较其前两者纯，其金标多抗的稳定性较好，辛酸-硫酸胺法纯化的抗大肠杆菌O157 IgG的活性较Protein G纯化的好，其金标多抗的稳定性较好，因此本试验采用Protein G法纯化抗Stx2B 血清，用辛酸-硫酸胺法纯化抗大肠杆菌O157血清。
志贺氏菌检验方法
未来展望与研究方向
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接种
将处理后的样品接种到培养基上，根据不同的实验需求，可采用不同的接种方法，如划线法、稀释法等。
培养基制备与接种
细菌鉴定
通过形态学观察、生化试验、血清学鉴定等方法，对培养出的细菌进行鉴定，以确定是否为志贺氏菌。
药敏试验
对鉴定的志贺氏菌进行药敏试验，以测定其对不同抗菌药物的敏感性和耐药性。
细菌鉴定与药敏试验
2023
《志贺氏菌检验方法》
志贺氏菌概述志贺氏菌的检验方法志贺氏菌检验的实验室操作流程志贺氏菌检验的临床意义及注意事项志贺氏菌检验方法的发展趋势与展望
contents
目录
01
志贺氏菌概述
志贺氏菌的特性
志贺氏菌是一种革兰阴性杆菌，无芽孢、无鞭毛，具有荚膜。
革兰阴性杆菌
需氧菌
耐酸
耐药性
志贺氏菌是一种需氧菌，生长繁殖需要氧气。
分离培养
通过对分离出的细菌进行形态学、生化反应等实验，确定是否为志贺氏菌。
鉴定
对分离出的志贺氏菌进行药敏试验，以确定其对抗菌药物的敏感性。
药敏试验
细菌培养法
酶联免疫吸附试验（ELISA）
免疫荧光抗体法
胶体金免疫层析法
免疫学检测法
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增志贺氏菌的特异性基因片段，以检测样本中的志贺氏菌。
免疫学方法中的ELISA等，可能会与其它相似菌种发生交叉反应，影响结果的准确性。
基因组学应用
01
利用基因组学技术，开发基于基因序列的检测方法，能够更快速、准确地检测志贺氏菌。
志贺氏菌实验室检测的漏检和误诊因素分析
醉 蔺 萄 枪 产 敌 产 气 ， 乳 格 、 健 荃 质 、 核 氮 破 和 动 力 阳 性 的 典 型 大
肠 杆菌． 极易与志贺氏 菌区 分： 另 一种为不 典型大肠杆菌． 其生 化 反应酷 似志贺氏菌（ ４ ） ， 如早期曾归入志贺氏菌属的孩性志 贺氏 菌（ Ｓ ｈ ｉ ｇ ｅ ｌ ａ ａ － ￣ ． ） 和殊异志贺氏菌（ ａ ｈ ｉ ｇ ｅ ｌ ｌ ｅ ｄ ｉ ａ ｐ ｅ ｒ ） ， 后来井人大肠杆菌， 并名之为大肠杆菌Ａ －Ｄ ｏ Ｅ ｄ ｗ ａ ｒ ｄ ｓ 等曾
索 稼 合 分 析 如 下 。
１ 志鱼氏，与大肠杆，表型特征的相似性
特 性 均 无 月 的 鉴 别 价 值 ， 其 中 常 用 来 与 志 贺 氏 曲 鉴 别 产 气 、 乳 ’
枪和动力， 大肠杆，阳性率均为９ ５ ％， 胶氛破为 ９ ４ ％， 旅羞质
志贺氏菌与肠杆菌科某些月（ 种） 表型特征的相似性是引 为９ ８ ％ 低活性大肠杆官产气和动力的阳性率仅为５ ％， 乳特 起肠检和误诊的，要因索。 现已 查明， 志贺氏菌与大肠埃希氏 为２ ５ ％ ， 较氮映为４ ０ ％， 健墓质为８ ０ ％； 而志贫氏 菌Ａ ， Ｂ ， Ｃ 群 菌（ 简称大肠杆菌》 不仅生化特性近似， 而且杭撅密切相关， 特 产气阳性＊为２ ％， 健谷质为 ８ ０ ％， 乳公（ Ｄ群宋内） 阳性卒为 别是与低活性大肠杆菌（ （ Ｅ ． ｏ ｕ ｌ ｉ ｉ ａｃ ｎ ｉ ｔ ｖ ｅ ） ， ２ ％， ４ 个群均无动力， 且艘氮徽困性。由此可见． 仅凭上述特 １ ． １ 生化反应的柯拟性 志贺氏茵与不发醉或迟发醉乳绪的 性， 即使检出结果的准确率为 １ ０ ０ ％ ， 也很难将志货氏菌与低 大肠杆菌在常用的选择性和鉴别性分离堵养基上均生长良好， 活性大肠杆，区别。 且蔺 落形态相似， 革兰氏 染色均为阴 性无芽杆菌。 １ ． ２ 枕原和关 性 Ｅ ｄ ｗ ａ ｒ ｄ ｓ 等（ ４ 曾描述了 大肠杆蔺Ａ －Ｄ的 多年来的研究发现， 大肠杆菌有两种生化类型。 一种为发 ５ 个Ｏ群（ ０ ： １ 一 。 ： ５ ） ， 每个０群至少与志贺氏菌月的７ 个皿
双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌Stx1和stx2基因
双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌Stx1和stx2基因赵爱兰;孟琼;白向宁;刘学通;刘凯;熊衍文【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(31)4【摘要】目的建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法.方法根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析.结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×102 copies/反应体系；该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100％；对模拟粪便标本的检测下限为3.55×103 CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养.结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查.【总页数】4页(P241-244)【作者】赵爱兰;孟琼;白向宁;刘学通;刘凯;熊衍文【作者单位】中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.产志贺毒素大肠杆菌 stx2基因荧光定量 PCR检测方法的建立及应用 [J], 汪伟;张雪寒;王润;何孔旺;温立斌;倪艳秀;周俊明;王小敏;李彬2.产志贺毒素大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶基因型的研究 [J], 李明成;李凡3.产志贺毒素EHEC国内分离株Stx2基因的克隆及生物信息学分析 [J], 唐中伟;周志江4.牛源非O157产志贺毒素大肠埃希菌耐药基因和毒力基因发生共转移 [J], 佟盼盼;张凌;谢金鑫;张萌萌;唐雪林;张毅;夏利宁;苏战强5.新疆牛、羊和骆驼源产志贺毒素大肠埃希菌的系统进化分群、血清群与毒力基因及耐药性分析 [J], 佟盼盼;张萌萌;陈文霞;刘璐瑶;张凌;唐雪林;苏战强;谢金鑫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产志贺毒素大肠杆菌O157:H-研究进展
产志贺毒素大肠杆菌O157：H-研究进展
王晓萌
【期刊名称】《浙江预防医学》
【年(卷),期】2004(016)008
【摘要】产志贺毒素(Shiga toxin，Stx)大肠杆菌(shiga toxinproducing E．coli，STEC)能引起出血性肠炎(hemorrhasic colitis，HC)、溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome，HUS)。
利用病原菌的生物表型特征建立经典的
实验室诊断程序对病原的鉴别尤为重要，特别是如O157：H7的山梨醇的迟缓发
酵性(sorbitol-fermenting，SF)。
但也存在例外，
【总页数】3页(P57-59)
【作者】王晓萌
【作者单位】浙江省疾病预防控制中心,浙江,杭州,310009
【正文语种】中文
【中图分类】R378.2+1
【相关文献】
1.一株不产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的鉴定 [J], 王蕾;叶长芸;
赵爱兰;许彦梅;徐建国
2.一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌O157：H7的分离与鉴定 [J], 张书萧;刘姑;邵东华;陈晓平;赵秋华;马志永
3.大肠杆菌O157和其它产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子——粘附素 [J], 严亚贤;华修国
4.产志贺毒素大肠杆菌检测技术研究进展 [J], 杨斌;邹杰;羊扬;朱国强
5.产志贺毒素大肠杆菌基因分型技术的研究进展 [J], 张世钦;汪雯;吉小凤;王梓晨;白芷烨;李红梅;王翔;董庆利
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产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析1李咏梅，李凡吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011E-mail：mayflower380@摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。
结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。
全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。
非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为63。
实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。
非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。
关键词：STEC；鉴定; 耐药性1．引言STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。
STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。
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志賀毒性大腸桿菌(STEC)的臨床實驗室檢驗陳星宇1孫俊仁2*1台北市立聯合醫院仁愛院區2三軍總醫院臨床病理科人類如果感染志賀毒性大腸桿菌 (shiga toxin–producing Escherichia coli ,STEC)會造成嚴重腹瀉。
即時且適當的診治可以減少病人併發嚴重腎臟疾病及改善病人預後。
所以實驗室如何正確診斷志賀毒性大腸桿菌就很重要。
以群聚感染爆發與感染控制的角度而言，實驗室必須能區分所流行的志賀毒性大腸桿菌血清型。
本篇文章為介紹臨床實驗室診斷志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程。
此流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗。
在台灣，志賀毒性大腸桿菌所造成的群聚感染並不常見，主要是跟我們熟食的飲食習慣有關。
但隨著生食主義及生機飲食的盛行，志賀毒性大腸桿菌感染的風險也相對提高。
臨床實驗室了解如何快速檢測志賀毒性大腸桿菌感染就顯得格外重要。
關鍵詞：志賀毒性大腸桿菌、志賀毒素志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)簡介志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)泛指會產生志賀毒素(shiga toxin)的大腸桿菌[1-3]。
大腸桿菌的分型主要依據O抗原及H抗原進行血清分型。
O抗原為表面抗原(Somatic Ag)而H抗原則為鞭毛抗原(Flagellar Ag)。
STEC亦可以專一性抗血清針對其表面抗原及鞭毛抗原進行分型。
舉例來說，STEC下最有名的E. coli O157:H7，別名為STEC O157:H7表示其所攜帶的表面抗原為O 157，而其所攜帶的鞭毛抗原為H7，並且可以產生志賀毒素。
STEC 在分類上可以區分成O157 STEC及Non-O157 STEC 兩類。
常見的STEC感染症主要是感染 E. coli O157:H7。
但是至少還有150種STEC血清型證實與群聚感染或是人類疾病有關，這些血清型別可以被歸類為non-O157 STEC。
在美國地區non-O157 STEC感染症與六株non-O157血清型(O26, O45, O103, O111, O121及O145)較為相關[4, 5]。
志賀毒素的命名最早是因為其毒素結構與功能類似於Shigella dystenteriae 所分泌之Shigella dystenteriae type 1[6]。
目前常見的Shiga toxin可以分成兩大類，分別為Shiga toxin 1 (Stx1)及Shiga toxin 2(Stx2) [7, 8]。
其他常見名稱像是verocytotoxigenic E. coli則是指其所分泌的志賀毒素會使Vero細胞株產生細胞病變現象。
因其會造成人類疾病主要是以腸道出血，所以又稱為enterohemorrhagic E. coli。
STEC感染主要會造成急性腹瀉(diarrhea)，此外約8%病人在感染後會出現溶血性尿毒症候群(hemolytic uremic syndrome, HUS)的症狀。
其他嚴症狀像是血小板減少症(thrombocytopenia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)及腎衰竭(renal failure)等症狀。
如果臨床上觀察到血栓性血小板低下性紫斑症(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)或是溶血性尿毒症候群伴隨腹泄癥候，則必須要懷疑為STEC感染[9, 10]。
但是，並非每個感染STEC病人都會出現溶血性尿毒症候群，出現症狀輕重與否與菌種毒性及宿主免疫力有直接關係。
而HUS 症狀則是無論是O157 STEC亦或是non-O157 STEC皆有可能造成[10]。
STEC造成的感染症主要是因為食用被STEC所污染過的食物(未煮熟的絞肉、受汙染的果汁、生菜及牛奶)、飲用收稿日期：100年10月12日通訊作者：孫俊仁三軍總醫院臨床病理科 台北市內湖區成功路2段325號臨床病理科電話：886-2-87923311 ext 88092 傳真：886-2-87927226 電子郵件：sun3342@ 綜 論志賀毒性大腸桿菌的檢驗水及與環境動物接觸或經由幼兒照護而傳染給幼兒。
根據文獻指出只要感染約100個O157 STEC病原菌即會出現症狀，但是其他的血清型並未有相關文獻報導。
有文獻指出使用抗生素治療STEC感染症，將會提高腎臟疾病的發生機率，並且增加併發嚴重副作用的風險[2]。
所以實驗室快速且正確診斷出STEC，將有助於臨床更改治療模式及避免使用抗生素以改善病人預後。
若實驗室能進一步快速鑑別診斷STEC血清型，將可避免病菌爆發群聚感染及後續感控措施的規畫。
所以，實驗室如何即時檢驗及診斷STEC的感染症將是一個重要的課題[10]。
臨床實驗室檢驗流程臨床實驗室進行STEC菌株之檢驗最好的檢體是腹瀉檢體(diarrheal stool)，腹瀉檢體的採集最好是在病人意識清楚且未使用抗生素前採集。
實驗室建議操作流程參照圖1。
腹瀉檢體採集後應儘快送往實驗室進行後續檢驗工作，檢體同時進行兩個不同檢驗流程，一為偵測志賀毒素：可以利用腹瀉檢體直接進行志賀毒素檢驗，確認檢體中是否有志賀毒素存在。
但臨床腹瀉檢體中的志賀毒素可能會因為較少而容易發生偽陰性的情況，所以實驗室如果偵測結果為陰性，則可再將這檢體接種於液態培養基進行增菌培養，第二天再以液態培養基偵測確認是否有志賀毒素存在[11]。
二為細菌培養：實驗室必須先操作臨床常見腸道腹瀉相關致病菌的培養(例如：沙門氏菌Salmonella、痢疾桿菌Shigella及彎曲桿菌Campylobacter )，以排除非其他病原菌所造成的腹瀉。
接著必須將檢體接種於對STEC具有專一性篩選的培養基，第二天於篩選培養基上篩選懷疑是STEC菌落，再與STEC專一性抗體進行凝集反應確認是否為STEC。
如果菌落與抗體產生凝集反應，則必須以傳統生化反應或自動鑑定儀器確認該菌落為大腸桿菌。
則此大腸桿菌即為會產生志賀毒素的大腸桿菌。
以下流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗[2]。
簡述如下：檢體採集與運送圖1 志賀毒性大腸桿菌檢驗流程檢體採集完成後，宜儘快送往細菌室進行後續相關檢驗工作。
目前市面上有販賣之的商業套組所偵測標靶為噬菌體(phage)所攜帶的志賀毒素。
如果檢體放置時間過久，可能會發生噬菌體溶解細菌而造成細菌死亡，毒素標靶將會消失不見而使志賀毒素結果為偽陰性[12]。
檢體如果無法馬上送往細菌室則建議把檢體進行冷凍保存並應該在24小時內進行相關檢驗工作，如果運送過程中有使用運送專用培養基(transport medium)進行運輸，則建議在48小時內進行檢測。
運送培養基必須選擇可以支持腸道細菌生長的運送培養基，例如：Cary-Blair運送液就是不錯的選擇。
實驗室如果要直接以腹瀉檢體偵測志賀毒素，則不建議將檢體加入運送培養基運送以避免稀釋檢體中的志賀毒素。
以培養方法偵測STEC根據前面所言，STEC可以區分成O157 STEC及non- O157 STEC兩大類，這兩大類在培養流程及鑑定程序上有極大差異。
在臨床醫學實驗室主要會遭遇的最大威脅為O157 STEC。
所以，實驗室所建立的培養鑑定流程應以O157 STEC為主。
一般大腸桿菌則為可以發酵山梨糖醇，但O157 STEC具有不會發酵山梨糖醇(sorbitol)[8]。
O157 STEC的培養可以直接將檢體接種在含有山梨糖醇的培養基培養進行篩檢，像是sorbitol-MacConkey agar (SMAC)、cefixime tellurite- sorbitol MacConkey agar (CT-SMCA)或CHROMagar O157[13]。
培養基體在經過37℃進行培養16-24小時後，在SMAC 或CT-SMCA 會出現無色菌落，但是如果選用CHROMagar O157培養基則會出現淡紫色或是粉紅色菌落。
接著選取單一菌落與O157-抗血清或乳膠試劑進行凝集反應。
倘若選取的菌落與O157-抗血清或乳膠試劑產生凝集反應且不與正常血清或是對照組進行反應，則可以初步認定所該菌株為O157 STEC 。
根據美國疾病管制局(Center for Disease Control and Prevention; CDC)建議，操作者至少須測試三個單一疑似菌落，若O157 STEC 在任何一個菌落偵測為陽性，則確定為陽性[2]。
為避免因為其他細菌會與O157抗血清產生交互反應，所以這偵測為陽性的菌落則必須次培養至SMAC 或是其他非選擇性培養基，並依實驗室鑑定流程鑑別為大腸桿菌。
後續鑑定為大腸桿菌，需耗時24小時以上，所以，當一發現O157 STEC 抗血清凝集則必須先行通報臨床醫師。
但是必須在完成O157 STEC 菌落分離並且與O157抗體凝集最後再以生化反應確認為大腸桿菌，才可以確診為O157 STEC 。
Non- O157 STEC 的培養鑑定通常執行的單位為食品、公衛相關實驗室為主。
Non-O157 STEC 對人類依然具有致病能力與爆發大流行的可能，因其血清型相當的繁多且皆對山梨糖醇與乳糖皆具有發酵能力，所以其篩檢在臨床微生物實驗室較為不易[10]。
Non-O157 STEC 建議篩選流程主要為先將檢體接種於液態培養基進行增菌培養接著偵測液態培養基中的志賀毒素。
如果偵測結果為陽性則必須分離至低選擇性的培養基進行篩檢(例如：MacConkey agar, SMAC, Statens Serum Institut [SSI] enteric me-dium, or blood agar)。
所有可能為STEC 菌落必須先以O157 抗體偵排除O157 STEC 則再利用其他偵測O 抗原之商業套組偵測STEC 的型別[2]。
非培養方法偵測STEC臨床上培養STEC 較為耗時且篩選過程較為繁瑣，且只有O157 STEC 可以利用山梨糖醇選擇性培養基進行篩檢。
所以微生物實驗室可以建置非培養方表1 各偵測志賀毒性大腸桿菌之方法學比較方法學原理 優點 缺點 以培養方法偵測STECO157 STEC 專一性培養基 O157 STEC 不會發酵山梨糖醇，培養基中含有山梨糖醇即可與一般大腸桿菌區分可以得到單一菌落進行確認試驗 無法鑑別其他Non-O157 STEC非培養方法偵測STEC1.商業產品有FDA 認可，可以即時偵測1.需要儀器進行偵測 酵素免疫法 (enzyme immunoassay, EIA) 利用專一性抗體偵測志賀毒素2.可以偵測其他Non-O157 STEC 2.無法區分血清型1.敏感度極高 1.需要細胞培養技術並且過程耗時細胞毒殺試驗 (Cell Cytotoxicity Assay)志賀毒素對Vero 細胞株及HeLa 細胞株具有毒殺作用 2.可用志賀毒素中和抗體確認 2.無法區分血清型目前尚未有FDA 認可及應用於臨床檢體 磁性抗體免疫磁珠分離法 (Immunomagnetic separation 、IMS) 利用在免疫磁珠上標定O 抗體專一性抓取O 抗原，最後再用磁鐵抓取免疫磁珠與檢體分離 1.可以得到較高濃度的病菌並初步純化2.可以區分血清型1.可以即時偵測並分血清型2.廣泛應用於食品篩檢目前尚未有FDA 認可的商業套組核酸增幅檢驗(nucleic acid amplification test,NAAT)以PCR 技術為以偵測DNA 為基礎的檢驗方法志賀毒性大腸桿菌的檢驗式先偵測志賀毒素或分子診斷技術偵測相關基因進行即時診斷STEC，目前常見的幾種方法介紹如下：酵素免疫法(enzyme immunoassay, EIA)非培養方式鑑別STEC的方法最常建議使用的方法以酵素免疫法偵測志賀毒素。