基因的克隆、表达载体构建与功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）
一、基因克隆
★事前三问
a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？
b.这个基因在哪种材料中扩增？
c.材料需要怎么处理？
◎实验前准备工作
a.设计引物，准备材料，
b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试
剂盒
c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准
备
※基本流程
提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序
1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成
1.1叶片、根总RNA的提取
Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。
1）实验前准备
预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。
2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：
（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。
（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。
（6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
（7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。
（9）配制以下体系：
10×DNase buffer 5 μl
DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl
RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl
Total RNA 70 μg
加去RNase水至总体积为50 μl
（10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。
（12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测
（1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。
（2）分光光度计RNA纯度检测
取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质
量。
4）cDNA第一条链的合成
按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：
1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
试剂名称使用量
模板RNA 1 μg
Oligo dT primer (50 μM) 1 μl
dNTP Mixture(10 mM) 1 μl
RNase free dH2O up to 10 μl
2）65 ℃保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。
3）离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。
4）在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液:
试剂名称使用量
上述模板RNA/引物等的混合液10 μl
5×Frist-Stand Buffer 4 μl
RNase Inhibitor(40 U/ μl) 0.5 μl
MTV RT ase (10 U/μl) 0.5 μl
RNase free dH2O up to 20 μl
5）37 ℃保温60 min。
6）95 ℃,5 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取
（1）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有：
1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml
4MNaCl 1.5 ml
10%SDS 5 ml
DEPC-H2O 41.25 ml
（2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 ℃水浴预热。
（3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。
（4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，12000rpm 4 ℃离心10 min。
（5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4℃离心10 min。
（6）取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 ℃保存过夜。
（7）离心10 min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。
（8）加入9 ul DNA酶(无RNA酶)，10 ul 10×buffer（DNA酶所带）和1 ulRasin（Rnas 抑制剂），37 ℃30分钟（再加500 ul水）
（9）取出用300 ul氯仿和300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm
4 ℃离心10 min。
（10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 ℃离心10 min。（11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇，-80 ℃冰箱过夜；
（10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80℃，备用。
2.2.2.1 cDNA第一条链的合成
（1）基因组DNA的去除反应
试剂使用量
5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ul
gDNA Eraser 1.0 ul
Total RNA 5 ul
RNase Free dH2O up to 10.0 ul
42 ℃2 min
4 ℃10 min
(2)反转录反应
试剂使用量
5xPrimeScript@Buffer 2(for Real Time) 4.0 ul
PrimeScript@RT Enzyme MixI 1.0 ul
RT Prime Mix 1.0 ul
①的反应液10.0 ul
RNase Free dH2O up to 20.0 ul
37 ℃15 min
85 ℃ 5 sec
4 ℃10 min -20 ℃保存备用
2.基因cDNA克隆
2.1基因片段的PCR扩增
以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20ul：10×PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs 1.6 ul，10 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0 ul，ddH2O补足至20 ul。按照下列条件进行PCR扩增：
94 ℃ 4 min
94 ℃ 30 sec
50 ℃ 40 sec 30 cycles
72 ℃ 1 min
72 ℃ 10 min
2.2 PCR扩增产物的检测和回收纯化
PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶(含有0.5 ug/ml溴化乙锭)上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：
1) 在紫外灯下切下将要回收的条带(尽量使用长波长的UV)，称重。
2) 按每100 mg 琼脂糖胶加入300 ul溶胶液PN，置于50 ℃水浴中10 min，每隔2 min 混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min。
3) 将UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入600 ul平衡液BL，13000rpm，离心30 sec。
3) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3 min，13000rpm，离心30 sec。
4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心30 sec。
5) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入500 ul漂洗液PW，13000 rpm离心30 sec，重复一次。
6) 取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2 min。
7) 将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70℃洗脱液EB，室温放置5 min。
8) 12000 rpm，离心l min，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20℃保存备用。
2.3 回收产物与PMD-T载体的连接与转化
采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转化。具体操作步骤如下：
SolutionI、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。
在0.2ml离心管中配制反应体系10ul：
PMD18-T 载体0.5 ul
SolutionI 5 ul
回收DNA产物 4.5 ul
混匀，16 ℃反应过夜（3h就可以）。
连接反应快结束时，从-80 ℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融化。
1）取5 ul 的连接产物加到50 ul 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min。
2）将离心管置于42 ℃水浴90 s，间不要摇动离心管。取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，其
3）向离心管中加入600-900 ul LB（不含抗生素）液体培养基，150r/min，37℃震荡培养60 min。
4）吸取150 ul 已摇好的菌液涂布在含有Amp(终浓度50 ug/ml)的LB固体培养基上，待液体完全被培养基吸收后，倒置平板，37℃，培养12-14小时。
2.4重组克隆的验证及序列测定
随机挑选5个左右单菌落于10 ml含50 ug/ml的LB液体培养基中，于恒温摇床37 °C，180r/min震荡培养过夜，培养至菌液OD600为0.6～0.8，用天根的质粒小提试剂盒提取质粒。也可按照下列步骤提取质粒：
1）将培养好的菌液倒入2.0 ml 离心管中，12000rpm离心1min，去掉上清液，再重复二次。
2）加入100 ul预冷的溶液P1涡旋使充分悬浮，室温静止5 min。
3）加入200 ul溶液P2，同一方向缓慢匀速转动离心管使溶液混合均匀，置冰上5 min。4）加入150 ul溶液P3，同一方向缓慢匀速转动离心管使内含物在溶液中分散均匀，置冰上5 min。
5）12000 rpm，离心10 min，取上清，用等体积的苯酚和氯仿:异戊醇(24:l)，各抽提一次。
6）12000 rpm，离心3 min，取上清。
7）向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃，放置30 min，12000 rpm，离心10 min。
8）弃上清，加入l ml75%乙醇，洗涤沉淀，12000 rpm离心3 min，弃上清，自然晾干。
9) 每管中加入30 ul TE (pH 8.0) buffer和1 μl RNase(10ug/ul )，37℃水浴30 min溶解质粒DNA,-20℃贮存备用。
溶液的配制：SolutionI:葡萄糖50 mM; EDTA(PH8.0) 10 mM;Tris-Hcl 25 mM
SolutionII:NaOH 0.2 M;SDS 1%(现用现配)
SolutionIII:乙酸钾60 mM;冰乙酸11.5 ml;ddH2O 28.5 ml 采用上文中的P1、P2特异性引物以质粒为模板进行PCR扩增，扩增结果与RT-PCR相同的质粒为验证的阳性质粒，由华大基因工程有限公司进行序列测定。
二、植物转化表达载体的构建
★事前三问
a.构建什么载体（过表达，干扰？还是别的）？酶切位点有哪些是可以用的？怎
么用方便？
b.载体的细菌抗性和筛选抗性分别是什么？
c.准备转到哪种材料里？用什么方法转？
◎实验前准备工作
a.选择一个合适的表达载体
b.酶切位点选择：用DNAMAN中的Restriction-Restriction Analysis 分析待插入
基因中包含的酶切位点，避免使用基因中已有的酶切位点。剩下的酶切位点的选
择依据的原则为：方便（酶反应温度、Buffer一样，可以双酶切）、快捷（可以
省时酶切）、便宜。
c.设计带酶切位点的引物
d.购置试剂：高保真酶或LA Taq酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连
接试剂盒等
e.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素
※基本流程
a.过表达载体
酶切#：如果两个酶可以同时酶切，就直接双酶切；如果不能，按以下方法进行以NcoI和BstEII为例和：
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建与功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.360docs.net/doc/102601860.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
目的基因的克隆与及表达
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中
目的基因的克隆表达
目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环
（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记