Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

一、实验目的

1，掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术；

2，掌握制作标准曲线的要领；

3，学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理

1，蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与Cu2+螯合形成蛋白质- Cu2+复合物，即发生双缩脲反应。而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基可以还原Folin-酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），即发生Folin-酚显色反应。同时，在碱性条件下Folin-酚试剂极不稳定，从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。

2，在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。故通过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。

三、材料和方法

样品：健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L

试剂：牛血清白蛋白标准液（200µg/ml）；碱性硫酸铜溶液（现配）；Folin-酚试剂

仪器与器材： V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸

实验步骤示意

详细步骤

A ，配置一定浓度梯度溶液: 取6支试管分别编号1至6，按下表加样。（1作空白对照，2-5作标准，6为待测样品）

1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。如此类推混匀并将其静置在室温下。

2，在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样10分钟后，于第1支试管立即加入0.20mL Folin-酚试剂，并于2s 内摇匀。1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。

B ，加样完毕后将各试管每隔1min 按1-6顺序放一只试管入水浴箱，分别40℃

水浴10min 后取出冷却至室温。

试剂（ml ）

空白管

标准管

样品管

1

2

3

4 5

6

牛血清蛋白标准液

- 0.20

0.40

0.60

0.80

- 样品液（稀释300倍）

-

-

-

-

-

0.50

蒸馏水 碱性硫酸铜 Folin-酚试剂 蛋白质浓度（µg/ml ）

1.0

2.0 0.20 0

0.80 2.0 0.20 40

0.60 2.0 0.20 80

0.40 2.0 0.20 120

0.20 2.0 0.20 160

0.50 2.0 0.20 未知

蛋碱性

混合均匀

加

2s 内

40℃

冷却

比

C，以500nm波长比色，以1号管作空白对照，按2-6顺序每隔一分钟测定一支试管内溶液吸光度并重复测三次，记下读数，求出平均值，记录数据并计算结果。

四、结果与讨论：

结果：

A，实验过程现象：

1，在向试管中加入2ml碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液澄清，无明显现象；2，在向试管中加入0.20mL Folin-酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液由浅绿立即先变黄后变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深。

B，吸光度数据：500nm波长吸收度值记录

测定次数

各管吸光度值A

500

2 3 4 5 6

1 0.063 0.119 0.173 0.22

2 0.148

2 0.059 0.119 0.171 0.219 0.150

3 0.06

4 0.118 0.17

5 0.212 0.140

各管平均值A—

500

0.0620 0.1187 0.1730 0.2177 0.146 （对照组的实验数据均为0）

根据吸光度数据绘制图表：

试管 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白标准液浓

度（µg/ml）

0 40 80 120 160 -

A500平均值0 0.0620 0.1187 0.1730 0.2177 0.146

将测得样品管吸光度0.1460代入标准曲线公式y=0.0013x+0.0125中，得出样品浓度为102.7µg/ml。

即：C

（未稀释蛋白含量）= C

（稀释后蛋白质含量）

×2×300

= 102.7µg/ml×600

= 61.62µg/ml

= 61.62g/L

正常人血清蛋白浓度参考范围为：60~80g/L

以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落在正常范围内，可认为本次实验成功。

讨论：

A：本次实验中操作严格按照实验要求进行，故所测样品结果61.62g/L落在正常范围内。与同实验室另一小组所测结果（61.80g/L）相比差距很小，故可认为本次实验成功。

B：实验误差分析如下：

1，在使用加样枪移液过程中可因试液未完全放入试管而有少许残留于移液枪头导致操作误差。

2，在使用分光光度计测吸光度时，因未能及时将溶液转移至比色皿而导致分别测定2-6试管时各组测定时间的时间间隔不一致，以及在读数时未等读数稳定就读数均可导致测量误差。

思考题

A.试述Folin-酚试剂法的优点？

答：该方法联用Folin-酚试剂法和双缩脲试剂法测定蛋白质含量可使显色反应更为明显，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

B.应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？

答：1，应用本方法的干扰作用：能干扰双缩脲反应的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂（如蔗糖，硫酸铵，巯基化合物等）的干扰以及反应的时间差异的干扰。

2，造成上述干扰作用的原因为：此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂而成，故所以凡干扰双缩脲反应的因素亦可干扰本方法。同时此反应的显色程度随反应时间的延长而不断加深，故反应时间的不一致亦为应用本方法的一个干扰作用。

3，因此需注意事项有：在实验过程中防止因操作不规范而引入干扰杂质以及严格的控制反应时间。