实验三 基因序列查找及PCR引物设计
PCR引物设计详细步骤
PCR引物设计详细步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于放大DNA片段。
在PCR过程中，引物的选择非常重要，因为引物的设计质量直接影响到PCR反应的效率和准确性。
本文将详细介绍PCR引物设计的步骤。
步骤1. 确定目标序列首先，需要确定所要放大的目标序列。
这可以是任何你感兴趣的DNA片段，如某个基因的编码区域，特定的DNA序列等。
2. 提取目标序列从已有的DNA样本中提取目标序列。
可以通过DNA提取试剂盒等方法进行提取，确保获得纯净的DNA。
3. 序列比对使用BLAST等工具将目标序列与已知的序列数据库进行比对，以确认目标序列的唯一性和可能存在的变异。
4. 引物设计原则根据目标序列，设计符合以下原则的引物：•引物长度通常在18-25个碱基对之间。
•碱基组成均匀，避免引物中存在大量的G或C碱基，以及连续多个重复的碱基。
•引物之间的互补性尽量避免，以防止二聚体的形成。
•避免引物末端存在碱基的互补序列，以防止非特异性扩增。
5. 引物设计工具使用引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等，在目标序列中选择合适的引物。
这些工具可以根据给定的参数，自动设计合适的引物。
6. 引物评估对设计的引物进行评估，包括检查引物的反向互补性、引物的Tm值（熔解温度）、引物的二聚体和自身结构等。
确保引物的质量达到实验要求。
7. 引物合成将设计好的引物发送给合成公司进行合成。
确保引物的纯度和浓度符合要求。
8. PCR反应使用合成的引物进行PCR反应，按照标准的PCR反应体系和条件进行。
根据实验需求调整PCR反应的温度、时间等参数。
9. PCR产物验证通过凝胶电泳等方法验证PCR反应产物的大小和纯度。
确保PCR反应成功，并且没有非特异扩增的产物。
结论PCR引物设计是PCR反应成功的关键。
通过遵循引物设计的原则，结合引物设计工具的辅助，可以设计出合适的引物，弥补PCR技术在DNA放大中的巨大优势，为实验研究提供有效的工具。
PCR引物设计
PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR引物的设计对PCR反应的成功与否至关重要。
下面将详细介绍PCR引物的设计过程。
第一步，选择目标序列。
在设计PCR引物之前，首先需要确定要扩增的目标序列。
目标序列可以来自已知基因的特定片段，也可以通过测序等方法获得。
第二步，引物长度和温度。
PCR引物通常为单链DNA片段，一般长度在18-30个碱基对之间。
引物长度过短容易引起非特异性扩增，引物长度过长则会导致特异性降低。
此外，引物的长度还会影响PCR反应的温度。
一般情况下，引物的长度越长，PCR反应的温度就需要越高。
通常，引物的长度最好在20-24个碱基对之间。
第三步，引物序列的选择。
为了确保PCR反应的特异性，引物的选择至关重要。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基序列，以确保引物能够精确结合到目标序列上。
此外，引物的序列还应避免序列内部的反向重复和结合位点之间的重复序列。
第四步，引物的熔解温度（Tm）的确定。
引物的熔解温度是引物与模板DNA结合的温度。
引物的熔解温度应该尽量接近反应的最低温度，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
引物的Tm可以通过以下公式计算：Tm = 69.3 + 0.41 * (G+C%) - 650/length其中G+C%表示引物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分含量，length表示引物的长度。
第五步，特异性分析。
在设计引物之前，可以通过生物信息学工具对引物进行特异性分析。
特异性分析可以通过引物序列与目标序列的比对来进行。
引物在目标序列上应有唯一的结合位点，并且不应该与其他非目标序列有任何重复的位点。
第六步，引物的杂交性能。
为了确保引物的杂交性能，引物应具有适当的糖尖端修饰和杂交性能。
糖尖端修饰可以增强引物的杂交性能，并减少非特异性结合。
此外，引物的GC含量应该适中，过高或过低都可能导致非特异性结合的问题。
第七步，引物的交叉反应。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
qPCR 引物篇(2)PCR 设计引物时如何查询基因
PCR 之引物设计--------基因序列查询篇•确定目标基因的形态：DNA or RNA•查找目标基因•比对目标基因同源性和特点•选取目标基因序列•选取目标基因的目标区段第一步：如何查基因：1、mRNA 序列的查询；以查大鼠cort为例；/search 选择11、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对象。
该mRNA文件的命名：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA；NM_012835：是唯一的编号；把以下序列存成ｔｘｔ文件：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA* Comment* Features* SequenceLOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008DEFINITION Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA.ACCESSION NM_012835VERSION NM_012835.1 GI:6978682KEYWORDS .SOURCE Rattusnorvegicus (Norway rat)ORGANISM RattusnorvegicusEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia;Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Rattus.REFERENCE 1 (bases 1 to 438)AUTHORS Xidakis,C., Mastrodimou,N., Notas,G., Renieri,E., Kolios,G.,Kouroumalis,E. and Thermos,K.TITLE RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence ofsomatostatin, cortistatin and somatostatin receptor subtypes in ratKupffer cellsJOURNAL Regul.Pept. 143 (1-3), 76-82 (2007)PUBMED 17481746REMARK GeneRIF: RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence of cortistatin in rat Kupffer cells.REFERENCE 2 (bases 1 to 438)AUTHORS Bourgin,P., Fabre,V., Huitron-Resendiz,S., Henriksen,S.J., Prospero-Garcia,O., Criado,J.R. and de Lecea,L.TITLE Cortistatin promotes and negatively correlates with slow-wave sleepJOURNAL Eur. J. Neurosci. 26 (3), 729-738 (2007)PUBMED 17686045REMARK GeneRIF: The capacity of CST-14 to increase SWA, together with preprocortistatin's inverse correlation with time spent in SWS, suggests a potential role in sleep homeostatic processes.REFERENCE 3 (bases 1 to 438)AUTHORS Deghenghi,R., Avallone,R., Torsello,A., Muccioli,G., Ghigo,E. and Locatelli,V.TITLE Growth hormone-inhibiting activity of cortistatin in the ratJOURNAL J. Endocrinol. Invest. 24 (11), RC31-RC33 (2001)PUBMED 11817718REFERENCE 4 (bases 1 to 438)AUTHORS de Lecea,L., Criado,J.R., Prospero-Garcia,O., Gautvik,K.M., Schweitzer,P., Danielson,P.E., Dunlop,C.L., Siggins,G.R.,Henriksen,S.J. and Sutcliffe,J.G.TITLE A cortical neuropeptide with neuronal depressant andsleep-modulating propertiesJOURNAL Nature 381 (6579), 242-245 (1996)PUBMED 8622767COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final NCBI review. The reference sequence was derived from U51919.1.Summary: inhibits growth hormone secretion; may act as aneuropeptide to mediate signaling via a somatostatin receptorsubtype [RGD].FEATURES Location/Qualifierssource 1..438/organism="Rattusnorvegicus"/mol_type="mRNA"/strain="Sprague-Dawley"/db_xref="taxon:10116"/chromosome="5"/map="5q36"gene 1..438/gene="Cort"/note="cortistatin"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"CDS 30..368/gene="Cort"/note="Preprocortistatin"/codon_start=1/product="cortistatin"/protein_id="NP_036967.1"/db_xref="GI:6978683"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"/translation="MGGCSTRGKRPSALSLLLLLLLSGIAASALPLESGPTGQDSVQDATGGRRTGLLTFLAWWHEWASQDSSSTAFEGGTPELSKRQERPPLQQPPHRDKKPC KNFFWKTFSSCK"sig_peptide 30..110/gene="Cort"mat_peptide 324..365/gene="Cort"/product="cortistatin-14"ORIGIN1 aaagcacagacttcaggtctccaaggaggatgggtggctgcagcacaagaggcaagcggc61 cgtcagccctcagtctgctgctgctgctgctgctctcggggatcgcagcctctgccctcc121 ccctggagagcggtcccaccggccaggacagtgtgcaggatgccacaggcgggaggagga181 ccggccttctgactttccttgcctggtggcatgagtgggcttcccaagacagctccagca241 ccgctttcgaagggggtaccccggagctgtctaagcggcaggaaagaccacccctccagc301 agcccccacaccgggataaaaagccctgcaagaacttcttctggaaaaccttctcctcgt361 gcaagtagcccgagcctgaccggagcctgaccggccaccctgtgaatgcagccgtggcct421 gaataaagagtgtcaagt//其中origin后面的序列，是我们用来设计的序列。
PCR引物设计方法及步骤
PCR引物设计方法及步骤查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。
接下来，我们将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。
PCR（polymerase chain reaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。
PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。
引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过T aq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
PCR引物设计方法
PCR引物设计方法引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA序列，从而使之得到大量复制。
而PCR引物是PCR反应中起到引导DNA扩增的关键组分。
本文将介绍PCR引物的设计方法，帮助读者更好地设计适用于特定DNA序列的引物。
引物的基本要求PCR引物应满足一定的要求才能确保PCR反应的成功。
以下是PCR引物的基本要求：1.引物长度通常为18-25个碱基对，过长或过短的引物均会影响PCR效率和特异性。
2.引物的GC含量通常在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的稳定性。
3.引物的3’末端应尽量避免G或C碱基，以减少引物之间的互补性。
4.引物之间的Tm（退半温度）差异最好在2℃以内，以确保引物能够同时结合在目标DNA序列上。
5.引物之间不应有明显的互补性，以免引起非特异扩增。
6.引物与非目标DNA序列的互补性应尽量避免，以确保特异性扩增。
PCR引物设计方法以下是一种常用的PCR引物设计方法：1.根据目标DNA序列，选择PCR引物的起始位置。
一般选择在目标序列两侧约200-300个碱基对的位置。
确保引物区域内无重复序列，避免非特异扩增。
例：目标DNA序列为ACGTAGCTAGCTAGC欲设计的引物起始位置为第5个碱基对，选取引物区域为AGCTAGCTAGC2.对引物区域进行BLAST查询，确保引物区域在目标DNA序列中没有互补序列。
例：通过BLAST查询，确认引物区域无互补序列3.根据引物区域设计引物的前向引物和反向引物。
引物长度通常为18-25个碱基对，GC含量应在40%-60%之间，3’末端避免使用G或C碱基。
例：前向引物为AGCTAGCTAGCGACGCGC反向引物为GCGCGTCGCTAGCTAGCT4.使用引物设计软件或在线工具（如NCBI Primer-BLAST）进行引物性能评估。
输入引物序列，并检查引物间的Tm差异是否在2℃以内，检查引物之间以及与非目标序列的互补性。
定量pcr引物设计的详细步骤
定量pcr引物设计的详细步骤宝子，来给你唠唠定量PCR引物设计的步骤哈。
一、确定目的基因序列。
你得先知道你要研究的目的基因是啥呀。
这就好比你要找一个小伙伴，你得先知道他长啥样。
你可以去一些基因数据库，像NCBI这种超厉害的地方，找到你要的那个基因的序列。
这个序列就像是这个小伙伴的身份证号码，是独一无二的哦。
二、引物设计软件选择。
有好多好用的引物设计软件呢。
比如说Primer Premier，这个就像一个贴心的小助手。
你把目的基因序列输进去，它就能开始帮你设计引物啦。
还有Beacon Designer也很不错哦。
这些软件就像是魔法棒，能在基因的海洋里给你捞出合适的引物来。
三、引物设计参数设置。
这一步很关键哦。
一般来说呢，引物的长度大概在18 - 25个碱基左右就好啦。
太短了就像小短腿，不太稳；太长了又像大长脚，容易出问题。
还有引物的GC含量，最好在40% - 60%之间。
这就像是一个黄金比例，能让引物和模板结合得更牢。
另外，引物自身不能有太多互补的地方，不然它自己就抱成一团，不跟模板好好玩啦。
四、特异性检查。
设计好引物之后，可不能就这么不管了。
得检查一下它的特异性呢。
这就像是给引物做个忠诚度测试。
你可以用BLAST这个工具，把你设计的引物序列放进去，看看它是不是只和你的目的基因结合，要是和其他乱七八糟的基因也有结合，那可不行，就像找错小伙伴啦。
五、引物合成。
如果前面的步骤都没问题啦，那就要把引物合成出来。
这时候就可以找专门的公司啦，就像把设计图交给工匠，让他们做出真正的成品。
合成好的引物拿回来，就可以开始你的定量PCR之旅啦。
宝子，按照这些步骤来，设计定量PCR引物就不是啥难事啦。
加油哦！ 。
qPCR引物设计原则及具体操作步骤
qPCR引物设计原则及具体操作步骤qPCR引物设计原则及具体操作步骤1.找基因（DNA）1)通过英文名称查找通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称→进入NCBI官网→点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面→在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可2)通过序列号查找通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。
例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。
3)通过引物查找通过查找文献，找到别人用过的对应的引物→在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST→输入正、反向引物序列→设置对应参数→点击“Get Primers”进行搜索即可4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存序列。
2.qPCR引物和TaqMan探针的设计1)引物设计注意事项a)引物长度17bp-25bp为佳。
太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出现引物高级结构的几率增加。
两者都会干扰定量结果的准确性b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180）c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算；d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA 含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。
e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。
f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能搭上g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的GC互搭h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者Ci)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种l)需跨外显子设计，避免基因组污染2)TaqMan探针设计指南a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。
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PCR仪
延伸：72℃ 循环数：20-30次
PCR仪
混合液
2-3 小时
电泳
凝胶成像系统
最终产物 紫外光观察
我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我 不喜欢做费力的事。作为一个发明 家,重要的一点是为解决某些问题而 尽力设计一个简捷的动手方案 Kary B. Mullis (1944 -) /
生化与分子生物学实验（二）
实验三 基因序列查找及PCR引物设计
长江师范学院生命科学系
陈发波
一、实验目的
1、掌握PCR扩增原理； 2、学会在NCBI网站上查找相关生物信息；
3、学会利用Primer5软件设计引物
二、聚合酶链式反应（PCR）
聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase
Chain Reaction，PCR）:
Mg2+, Tris缓冲液溶液等
PCR反应步骤
பைடு நூலகம் DNA解链（变性）
引物与模板 DNA 相结合（退火） DNA合成（延伸）
重复以上三个步骤
经多次循环之后，反应混合物 中所含有的双链 DNA 分子数，即 两条引物结合位点之间的 DNA 区 段的拷贝数，理论上的最高值应是 2n 。
反应仪器
变性：94℃
三、基因序列查询
BCBI（美国国立生物信息中心） 主页： / Mapview： /mapview/ind ex.html
四、引物设计
引物设计有3条基本原则：
1、引物与模板的序列要紧密互补
2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹 结构
3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)
引物设计考虑的主要因素 1、引物长度：一般18-24个碱基对 2、相似性较高序列
3、引物二聚体或发夹结构
4、引物序列的GC含量：一般为40-60%
五、作业 1、在NCBI上查找一段基因序列，将碱基序列
是利用DNA片段旁侧两个短的 单 链 引 物 ， 在 体外快 速扩增特 异 DNA片段的技术。
PCR基本原理
反应材料
模板DNA
引物对
按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；
DNA聚合酶：耐高温
Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymerase
dNTP 缓冲液溶液
抄在实验报告上，标明基因名称、基因编号。
2、利用Primer5 软件设计一对与你查询基因 序列相应的PCR扩增引物。