第四章 核酸操作的基本原理
核酸的序列测定基本原理
核酸的序列测定基本原理
核酸序列测定是指确定DNA或RNA分子中的碱基序列。
核酸序列测定的基本原理是利用化学或生物学方法将核酸样本分解成单个的核苷酸，然后通过测量样本中每个核苷酸的数量和顺序来确定核酸的序列。
最早的核酸测序方法是Sanger测序法，该方法利用DNA聚合酶和DNA链终止剂进行DNA合成反应，生成一系列长度不同的DNA片段。
然后将这些片段通过电泳分离，并根据使用的DNA链终止剂的不同，确定每个片段的末端的核苷酸。
现代的核酸测序方法主要使用高通量测序技术，例如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等。
这些技术利用不同的原理，如合成、电泳、光学或纳米孔技术等，以高通量和高精度的方式进行核酸测序。
总之，核酸测序的基本原理是将核酸样品分解成单个核苷酸，然后通过测量每个核苷酸的数量和顺序来确定核酸的序列。
核酸的提取原理
核酸的提取原理
核酸的提取原理主要包括以下几个步骤：细胞破碎、核酸分离、蛋白质去除和纯化。
首先，细胞破碎是将待提取的细胞样品通过物理或化学方法破坏细胞膜，使细胞内的核酸暴露出来，常见的方法有机械破碎、温度变化、酶解等。
细胞破碎后，核酸与其他细胞成分如蛋白质、碳水化合物等混合在一起，因此需要进行核酸的分离。
分离方法主要有酚-氯
仿萃取法、硅胶柱层析法和离心沉淀法等。
酚-氯仿萃取法通
过酚的亲脂性和氯仿的亲水性选择性地萃取核酸。
硅胶柱层析法则是利用硅胶封填在滤柱中，利用核酸与硅胶的亲附作用来纯化核酸。
离心沉淀法是通过高速离心将核酸从样品中沉淀下来。
在核酸分离的过程中，常常伴随着蛋白质的存在。
蛋白质的存在会干扰核酸的定量和纯度检测，因此需要进行蛋白质去除的步骤。
常用的去除蛋白质的方法有蛋白酶处理、酸性酒精沉淀和有机溶剂提取等。
最后，为了提高核酸的纯度和浓度，还需要进行纯化步骤。
纯化方法有乙醇沉淀法、酚-氯仿萃取法、离心过滤法等。
综上所述，核酸提取原理是通过细胞破碎、核酸分离、蛋白质去除和纯化等步骤将待提取样品中的核酸分离出来，以获得高质量的核酸样品。
核酸提取原理及方法
核酸提取原理及方法核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从细胞或组织中分离出核酸并净化的过程。
核酸提取的成功与否直接影响到后续的实验结果，因此掌握核酸提取的原理和方法对于科研工作者来说至关重要。
一、核酸提取原理。
核酸提取的原理主要包括细胞破碎、核酸溶解和净化三个步骤。
首先，细胞膜和细胞壁需要被破坏，以释放细胞内的核酸。
其次，核酸需要被有效地溶解，使其能够被提取出来。
最后，通过净化步骤去除蛋白质、多糖和其他杂质，从而得到纯净的核酸样品。
二、核酸提取方法。
1. 酚氯仿法。
酚氯仿法是最常用的核酸提取方法之一。
其原理是利用酚和氯仿两种有机溶剂与水相不相溶的特性，将细胞裂解液中的蛋白质等杂质分离出去，从而得到纯净的核酸。
这种方法操作简单，适用于提取大量样品。
2. 硅胶柱法。
硅胶柱法利用硅胶膜对核酸的亲和力进行提取和分离。
通过将样品加入硅胶柱后，核酸能够与硅胶膜结合，而其他杂质则被洗脱掉。
这种方法提取的核酸纯度高，适用于对纯度要求较高的实验。
3. 磁珠法。
磁珠法是近年来发展起来的一种核酸提取新方法。
通过在磁珠表面修饰亲核酸的功能基团，使得核酸能够与磁珠结合。
利用磁场的作用，可以将核酸与磁珠分离出来，从而实现核酸的提取和纯化。
这种方法操作简便，且适用于高通量提取。
三、注意事项。
在进行核酸提取时，需要注意以下几点：1. 样品的质量和保存对提取结果有重要影响，因此在提取前需要确保样品的完整性和纯度；2. 根据不同的实验目的和样品特点选择合适的提取方法，以确保提取效果；3. 在操作过程中要注意无菌操作，避免外源性核酸的污染；4. 核酸提取后，应根据实验需求储存或立即进行下一步实验。
总结，核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，掌握核酸提取的原理和方法对于科研工作者来说至关重要。
不同的提取方法有着各自的特点和适用范围，选择合适的提取方法能够提高实验效率和结果的准确性。
在实验操作中要严格按照操作规程进行，确保提取的核酸样品质量和纯度。
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的基本原理是互补配对。
DNA由四种碱基组成，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
在DNA的双链结构中，A总是与T互补，G总是与C互补。
RNA的组成与DNA类似，但胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代。
1.样品制备：将待检测的核酸提取和纯化，通常使用的方法有酚/氯仿法或商用试剂盒。
2.样品标记：将一条核酸链标记上荧光物质或放射性同位素，以便于后续的检测和可视化。
标记通常使用DNA或RNA标记试剂盒来完成。
3.杂交：将待检测的样品核酸与已知碱基序列的探针核酸杂交。
探针核酸是一条已知序列的DNA或RNA，在实验中作为参照物。
杂交条件包括温度、盐浓度和时间等。
4.杂交后处理：将杂交的核酸片段进行洗脱和处理，以去除未杂交的核酸。
这可以通过水洗、盐洗或酶处理等方法来完成。
5.分析和检测：通过荧光显微镜、放射计数器或PCR等方法来检测和分析杂交的核酸。
可以测量荧光强度、放射性计数或扩增产物的数量等，以确定核酸的相互作用或特定序列的存在。
核酸分子杂交技术在生物医学研究和诊断中具有广泛的应用。
例如，它可以用于检测病毒感染、基因突变、基因表达差异以及遗传性疾病的诊断等。
此外，核酸分子杂交还可以用于基因组和转录组的分析，帮助科学家理解基因调控、进化和物种间关系等重要生物学问题。
综上所述，核酸分子杂交技术基于互补配对原理，通过使两条互补的核酸链结合，来研究DNA和RNA的相互作用和序列特征。
它是一种重要的实验技术，在生物医学研究和诊断中得到广泛应用。
核酸的生化基础与检测原理(新冠肺炎核酸检测学习专家课堂)
碱基配对
• 双螺旋结构
• DNA 复制
• DNA 聚合酶催化
与核酸检测相关的理化特性
1.紫外吸收
• 在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，在260 nm有吸收。 • 核酸定性、定量、纯度测定的依据。 • 根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度
纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0
纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量
260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA 或相当于40μg/ml单链DNA或RNA 或相当于20μg/ml寡核苷酸
2. 核酸的水解
• 核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两 性解离。大于4时，呈阴离子状态。
（一）反应体系 2.引物（Primer) 设计原则：
• 设在待扩增目的片段的双侧两端，并分别与模板正负链碱基序列互补。 • 长度以15至30个核苷酸为宜 • 两条引物之间（尤其3-OH未端）的序列不能互补 • 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。C+G 比例以45%-
55%。引物3端尤其要避免重复的CG碱基序列。
二
PCR 技术
核酸扩增技术
• Thermocycling based
• PCR (Polymerase Chain Reaction, Roche Diagnostics) • Reverse Transcription-PCR ("RT-PCR") • Pre-Post versus Real-Time PCR • Multiplex PCR • Nested PCR • On-Array-PCR • Digital PCR
核酸的生化基础与检测原理(新冠肺炎核酸检测学习专家课堂)
核酸的生化基础与检测原理一核酸的生化基础与特性二PCR 技术三实时荧光PCR技术四其它核酸检测技术一核酸的生化基础与特性核酸可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA） 是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成，其基本结构单位是核苷酸。
核酸戊糖 碱基磷酸 核苷核苷酸核酸核苷酸核酸是通过一个核苷酸的C3 ′-OH 与另一分子核苷酸的5 ′-磷酸基形成3 ′,5 ′-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。
5’3’5’3’核酸的一级结构∙由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP四种脱氧核苷酸通过3´, 5´ -磷酸二酯键按一定顺序排列而成的高分子化合物。
∙一级结构的走向为5´→3´。
不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。
碱基配对• DNA 复制•DNA 聚合酶催化• 双螺旋结构与核酸检测相关的理化特性1.紫外吸收•在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，在260 nm有吸收。
•核酸定性、定量、纯度测定的依据。
•根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度纯DNA：A260/A280=1.8纯RNA：A260/A280=2.0纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA或相当于40μg/ml单链DNA或RNA或相当于20μg/ml寡核苷酸2. 核酸的水解•核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离。
大于4时，呈阴离子状态。
•核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。
•DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。
室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。
•在细胞内核酸分子受DNA酶作用。
•避免RNases的污染是在物理或化学因素作用下核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。
3.DNA的变性能引起核酸变性的因素有：l 温度升高l 酸碱度改变、 pH（>11.3或<4.0）l 有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等l 低离子强度。
核酸制备的一般方法和原理
核酸制备的一般方法和原理
核酸制备的一般方法和原理包括DNA和RNA的提取和纯化。
DNA提取的一般方法和原理：
1. 细胞破碎：细胞膜和细胞壁被破坏，使得细胞内的DNA暴露出来。
常用的方法有物理破碎（如超声波、高压、研磨等）和化学破碎（如细胞裂解液、裂解酶等）。
2. DNA溶解：使用缓冲液将DNA从其他细胞组分中分离出来。
3. DNA纯化：通过去除杂质和其他有机物质，纯化DNA。
通常通过加入醇类（如异丙醇或乙醇）来沉淀DNA，然后用洗涤缓冲液清洗。
4. DNA溶解和保存：通过溶解buffer将DNA溶解在溶液中以便后续使用，并存储在低温下。
RNA提取的一般方法和原理：
1. 细胞破碎：细胞膜和细胞壁被破坏，使得细胞内的RNA暴露出来。
常用的方法有物理破碎（如超声波、高压、研磨等）和化学破碎（如细胞裂解液、裂解酶等）。
2. RNA溶解：使用缓冲液来分离RNA。
3. RNA纯化：通过去除杂质和DNA、蛋白质等有机物质，纯化RNA。
通常通过加入醇类沉淀RNA，然后用洗涤缓冲液清洗。
4. RNA溶解和保存：将RNA溶解在溶液中以便后续使用，并存储在低温下。
DNA和RNA的提取和纯化方法基本相似，主要的区别在于RNA的提取需要加入RNase来去除DNA的污染。
核酸的检测原理范文
核酸的检测原理范文核酸检测是目前新冠病毒检测的常用方法之一、其原理是通过提取样本中的核酸（RNA或DNA），然后通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）或核酸序列扩增技术（例如PCR）来检测病原体的存在。
核酸检测的过程分为样本预处理、核酸提取、逆转录和定量PCR放大、检测结果分析等步骤。
首先，在样本预处理过程中，需对采集的样本进行处理，以确保样本中的病原体核酸的完整性和纯度。
例如，对于呼吸道样本，需要将样本中的黏液和其他成分分离以减少干扰物。
样本预处理的目的是清除可能存在的抑制核酸扩增的物质，并提高核酸的纯度，从而提高检测的灵敏度。
接下来，核酸提取是将样本中的病原体核酸从细胞或病毒颗粒中提取出来的过程。
通常使用化学方法或磁珠来提取核酸。
在提取的过程中，核酸提取试剂将与样本中的核酸结合，在特定的条件下，核酸与蛋白质、细胞膜等分离。
提取出的核酸作为RT-PCR或PCR的模板。
然后是逆转录过程，主要用于检测单链RNA病毒，如新冠病毒。
在逆转录过程中，使用逆转录酶将RNA模板转录成相应的DNA。
逆转录常采用聚合酶链反应（PCR），使用逆转录酶和特定的引物或逆转录试剂，将RNA反转录成相应的DNA。
这一步的主要目的是将RNA转化为双链DNA，为接下来的PCR扩增提供模板。
最重要的是定量PCR放大过程，PCR扩增技术根据样本中核酸的模板序列，使用特异性引物和酶来扩增目标序列。
PCR一般采用热循环反应，通过多个温度区域进行不同的反应步骤，如变性、退火和延伸，从而在每个循环中扩增DNA序列。
这样经过多个循环后，目标序列会被指数级扩增，放大到检测的可识别范围。
PCR的结果可以通过凝胶电泳等方法进行直观的检测，也可以利用实时定量PCR设备进行定量分析。
最后，检测结果分析是对核酸扩增反应体系进行读数和结果判断。
使用荧光或吸光度测定，定量PCR设备可以实时测量PCR反应中特定荧光信号的增长，并根据设定的标准曲线来确定目标序列的数量。
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第一节 核酸的提取与纯化
制取核酸样品的根本要求是保持核酸 的完整性
防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏
一、DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、
氯仿等有机溶剂 DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在 提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA
在低电压(5v/cm)时, 迁移速率与电压成正比
5、嵌入染料
溴化乙啶使线状DNA迁移率降低15％。
6、 离子强度影响
pH 影响DNA分子所带的电荷 (TAE TBE)
二、琼脂糖变性胶电泳
未变性的RNA，电泳时与电泳迁移率没有严格的相 关性
在变性条件下电泳，才能使RNA移动距离与其相对 分子量对数成正比。
2. 琼脂糖凝胶电泳法
核酸分子是多聚阴离子, 在电场中向正电极 的方向迁移
在一的电场强度下，DNA分子的电泳迁移 率，取决于核酸分子本身的大小和构型。
原理： DNA与溴化乙锭（EB）形成
的络合物 在紫外光照射下能发 射荧光，荧光的强度与DNA的含 量成正比。
因此可十分敏感而方便地检 测出凝胶介质中 DNA 。
5.水抽提法
• 利用核酸溶解于水的性质, 用低盐溶液 除去RNA
• 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一 般不用.
（三）核外 DNA 的提取
核外DNA包括： 质粒DNA
碱裂解法 煮沸法 去污剂裂解法
线粒体DNA 叶绿体DNA
先分离完整的 细胞器
提取纯化原理 与质粒DNA相同。
二、 RNA提取的基本原理与方法
紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法
1.紫外光度法原理： DNA或RNA分子在260 nm处有特异
吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA 的浓度成正比。
方法：
首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品 用TE或ddH2O为空白对照，在260 nm及280
nm处调节紫外分光光度计读数为0 加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD值
2.琼脂糖电泳的影响因素
1、 DNA的分子大小: 迁移速率与DNA分子量对数成反比
2、 琼脂糖浓度 迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 <0.5kb胶浓度是1.2-1.5%, >10kb胶浓度为0.3-0.7%, 两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象
SC>OL,L
4、电源电压
（一） 总RNA提取的基本原理与方法 1.总RNA提取的基本原理
RNA分离的关键因素是尽量减少RNA 酶 ( RNase) 的污染
造成RNase酶污的主要来源有 : 所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及
飞沫
玻璃器皿：烘箱中(180℃) 烘烤 8h 以上 , 塑料器皿：
0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate, 二乙基焦 碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤 ; 配置的溶液应尽可能用 0.1% DEPC在37℃处 理12h以上,然后高压灭菌 ; 全部实验过程均需戴手套操作,并经常更换 ; RNA 电泳槽常用去污剂洗涤,0.1%DEPC处理
根据谱带的形状可反应DNA 的质量
SUCCESS
THANK YOU
2020/2/8
• 同时 , 通过同已知分子质量的 标准 DNA 片段之间的比较 , 还 可测定出随迁移的 DNA 片段的 分子质量。
SUCCESS
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2020/2/8
四 核酸的保存
(一)、 影响核酸保存的关键因素 关键的因素是保存液的酸碱度和保存温度。
分离出来
（二）基本步骤
破壁： 破1.液碎氮细研胞磨并对2.D快NA速快加速入实提施取缓保冲护液 变性: 使1.核离子酸变和性蛋剂白、质去的污复剂合2体.酚解、离氯仿 复性: 将1.核无酸水从乙其醇它大2.分异戊子醇中分离出来
（二）、DNA提取的几种方法
浓盐法 SDS法 CTAB法 苯酚抽提法 水抽提法
• 2.总RNA提取的方法
异硫氰酸胍 -氯化铯超速离心法 盐酸胍-有机溶剂法 氯化锂 -尿素法
（二） mRNA 的提取
一般有两条途径： 其一是先提取细胞总 RNA, 然后再从中
分离带 poly(A) 的 mRNA; 其二是先提取多聚核糖体 , 再将蛋白质
与 mRNA 分开。
三、核酸的检测
RNA变性剂有二种，乙二醛-二甲基亚砜（DMSO） 甲醛
三.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
PAGE 为垂直板凝胶电泳
基质： 由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺双体聚合
分辨能力： 其分辨力为为1bp-4kb范围之间的DNA片段 凝胶浓度越大，分辨能力越强
破碎细胞
1.浓盐法
核酸
2.SDS （十二烷基硫酸钠）法
SDS 释放核酸 沉淀蛋白 质及多糖
核酸
上清液
3.CTAB（十二烷基三乙基溴化铵）法
CTAB
与核酸形 成复合物
溶解
沉淀
核酸
沉淀溶于 高盐溶液
4.苯酚抽提法
• 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 • 离心分层后取出水层，多次重复操作， • 合并含DNA 的水相，用乙醇沉淀DNA 。 • 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态
一、电泳的原理
核酸分子是多聚阴离子，在电场中向正极的
方向迁移
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决
于核酸分子本身的大小和构型
1．琼脂糖凝胶电泳（agrose gel electrophisis）
基质： 常熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖
分辨能力： 0.2-50kb 凝胶浓度越大，分辨能力越强
1. 保存液的酸碱度 水、过酸过碱可以断裂核酸的氢键
2. 保存温度 温度升高会降低核酸的稳定性, 所以
核酸一般都是低温保存。
(二 )、核酸制品的保存方法
• 保存条件
溶液： TE (tris-Hcl EDTA pH8.0)
ddH2O 温度： -70 ℃
一年以上
-20 ℃
半年左右
4℃
数月内
第二节 凝胶电泳技术
。
浓度计算（单位：μg/ml)
双链DNA（ds DNA） =50×OD260×稀释倍数
RNA(ssRNA)浓度 =40× OD260×稀释倍数
单连DNAssDNA =33× OD260×稀释倍数
纯度检测 可通过OD260/ OD280来衡量 OD260/ OD280为1.8左右为好
＞1.8为RNA污染， ＜1.8为蛋白质污染