Whiplash试验流程
Westerblot 试验操作步骤
Westerblot 试验操作步骤一、蛋白样品制备WIP组织细胞裂解液（塞池）取出WIP裂解液，待融化后颠倒混匀数次，适量分装冻存。
在使用前取出PMSF（100mM），按比例加入（使其最终浓度为1mM）混匀，立即使用。
取Ep管，分别称重标记，把组织剪成小块装入Ep管中，称重。
按每20毫克组织家100—100微升的比例加入WIP（如裂解不完全，可以适当增加WIP的用量；如需要的蛋白样品浓度较高，可以适当减少WIP的用量）。
用手握式电动组织细胞匀浆器匀浆约1分钟或直至充分裂解。
10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
如果组织样品本本身非常细小，如淋巴细胞，可直接加入WIP裂解液，通过震荡（vortex）以使样品裂解完全。
注意事项：(1)为获得最佳的实验效果，可适当分装使用，以尽量避免反复动融。
(2)PMSF应现用现加(3)裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
(4)蛋白酶抑制剂均有较高的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，一旦直接接触，请立即用流水冲洗，再向医疗保健结构咨询。
二、蛋白浓度测定：采用BCA法。
（WIP裂解液中含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法进行蛋白定量。
）三、SDS-PAGE的配制：分离胶12%，浓缩胶5%1 试剂及配制：（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g；去离子水至100ml；过滤，避光，4℃贮存1个月。
（有毒）（2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：Tris碱18.15g→80ml去离子水→浓盐酸调节PH至8.8→去离子水至100ml；4℃贮存。
（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）Tris碱12.1g→80ml去离子水→浓盐酸调节PH至8.8→去离子水至100ml；4℃贮存。
（4）10%SDS:10g SDS→100ml去离子水；室温贮存。
western_blot
设立对照样品 为了验证凝胶电泳及转膜正常进行，检测样品应同时与阴性对照和阳性对照同时进 行凝胶电泳和转膜。
膜的选择 常用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF 膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记 (Reprobing)（PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中仪增加膜的亲水性）。而硝酸纤维素 膜虽不需要浸泡但极易破碎。
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③ 封闭前的注意事项
膜标记好正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用有色分子量Marker或转膜后可在 膜上稍微剪断一个角（可自由决定剪断方向）。
封闭剂的选择 有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及 标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。
目的蛋白质量较差
IB RD 增加蛋白电泳量。
抗体量不充分 标记抗体失活
IB RD
有可能目的蛋白对应的抗体亲和性较弱。提高抗体浓度。 抗体活性有可能下降。Dot blot试验确定抗体活性。
使用不含有叠氮化钠的抗体。叠氮化钠阻碍HRP活性。
发光底物劣化
调查底物活性。可以少量调制working solution，暗室内加入少量HRP标识抗体观察是否有蓝光出 现。如果没有蓝光出现，说明底物或HRP标识抗体已经劣化。 注意装有试剂的瓶子不要出现污染。保存的底物试剂与其他试剂混合，也有可能导致底物劣化。
① 电泳前的注意事项
凝胶的选择 如果已知目的蛋白的分子量，选择的分离胶浓度应使蛋白质的迁移位置在中央。如 果是未知分子量的蛋白质样品，使用梯度凝胶。
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA 工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
简述免疫组化实验流程及注意事项
简述免疫组化实验流程及注意事项English Answer:Immunohistochemistry (IHC) is a powerful technique used to visualize the expression and localization of specific proteins within tissue sections. It involves the use of antibodies to bind to the target protein, followed by enzymatic detection to produce a colored precipitate.IHC Experiment Workflow:1. Tissue preparation: Tissue samples are fixed, dehydrated, and embedded in paraffin wax or frozen for optimal preservation.2. Sectioning: Thin tissue sections (typically 5-10 μm thick) are cut using a microtome and mounted on slides.3. Deparaffinization and rehydration: Paraffin-embedded sections are deparaffinized with xylene or other solventsand rehydrated through a graded series of ethanol solutions.4. Antigen retrieval: Certain antigens may requireheat-induced or enzyme-induced antigen retrieval to expose their epitopes.5. Blocking: Non-specific binding is blocked using a blocking solution, such as bovine serum albumin or goat serum.6. Primary antibody incubation: The specific primary antibody is applied to the tissue section and incubated to allow binding to the target protein.7. Washing: Excess unbound antibody is removed by washing with a buffer solution.8. Secondary antibody incubation: A secondary antibody conjugated to an enzyme (such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) is added to bind to the primary antibody.9. Washing: Excess secondary antibody is removed by washing with a buffer solution.10. Chromogenic substrate application: A chromogenic substrate is added to the section, which reacts with the enzyme bound to the secondary antibody to produce a colored precipitate.11. Counterstaining: The tissue section is counterstained with a dye, such as hematoxylin, to provide contrast and cellular visualization.12. Mounting: The stained section is mounted with a coverslip for preservation and examination.注意事项：Use high-quality antibodies specific for the target protein.Optimize antibody concentrations and incubation times to achieve optimal staining results.Control for non-specific staining by using appropriate negative controls.Interpret results with caution, considering factors such as tissue preparation, antibody specificity, and staining intensity.中文回答：免疫组化实验流程：1. 组织制备，对组织样本进行固定、脱水、包埋于石蜡中或冷冻，以获得最佳保存效果。
外斐氏反应标准操作过程
外斐氏反应标准操作过程2012-02-01 14:38:17 作者：佚名来源：网络转载[原理]：WFR也称作变形杆菌集试验，用来诊断流行性斑疹伤寒、恙虫病等急性传染病。
这些疾病的病原体是立克次体。
[操作步骤]：1. 以生理盐水将菌液稀释成每ml含7亿个菌的悬液。
2. 将血清标本做[原理]：WFR也称作变形杆菌集试验，用来诊断流行性斑疹伤寒、恙虫病等急性传染病。
这些疾病的病原体是立克次体。
[操作步骤]：1. 以生理盐水将菌液稀释成每ml含7亿个菌的悬液。
2. 将血清标本做2倍系列稀释，使成1：10、1：20，……1：1280（每管0.5ml）。
3. 然后逐管分别加入稀释菌液各0.5ml，血清稀释度即增为1：20，1：40……1：2560，充分振荡混匀，于37℃放置16—20小时。
[结果判断]根据凝集反应的强弱或有无，分别以++++、+++、++、+、+/-、-记录，以呈现（+）的血清最高稀释度作为终点效价。
[临床意义]: 正常人的滴度（血清稀释倍数）不超过1：20（1）增高：流行性斑疹伤寒（OX19阳性率可100%）；地方性斑疹伤寒（OX19部分可达1：200－1：800）；恙虫病忠者，患病后第一周OXK有14%在1：80以上。
第四周可达80%。
（2）布氏杆菌病、回归热病人血清中滴度也有所增高。
孕妇可稍有增高。
[参考值]: 凝集法：OX2〈1：160 OX19〈1：160 OXK〈1：160[注意事项]1.应在光亮处先观察管底凝集状态，然后轻轻摇动判定结果，不能激烈振荡。
2.菌液稀释后应及时使用。
3.菌液有摇不散的凝块时，不能使用。
4.应在有效期内使用。
提取虾废弃物中的蛋白质
2016/11/2
2016/11/2
提取虾废弃物中的蛋白质
提取虾废弃物中的蛋白质
实验方法：碱溶液法提取蛋白质 实验原料：龙虾残余物 实验试剂：95%乙醇、4%~6%盐酸、乙 醇、NaOH、高锰酸钾、氯化钠等 实验仪器：恒温水浴锅、电子天平、鼓 风干燥机等
2016/11/2
提取虾废弃物中的蛋白质
实验原理：由于蛋白质是两性化合物，蛋白质的溶解 度大，蛋白质的溶解度和稳定性与PH值关系很大，提 取液的PH值首先要保证在蛋白质稳定的范畴内，通常 选择在等电点的两侧。绝大部分蛋白质易溶于稀碱， 稀碱溶液可以进入细胞内部，由于蛋白质是两性化合 物，在一定的碱性环境中，蛋白质以一定离子形式溶 解于稀碱溶液内，进而提取细胞中的蛋白质 提取率计算：
提取虾废弃物中的蛋白质
具体内容
实验内容：提取虾废弃物中的蛋白质， 并探讨虾废弃物资源化利用 实验意义：
2016/11/2
1、利用龙虾加工废弃物提取蛋白质，既 可以充分利用资源，减少环境污染，还能 开发新型食品，创造巨大经济价值，带动 龙虾产业发展 2、可以让我们更好的理解生物化学中蛋 白质的有关知识，学以致用。
2016/11/2
提取虾废弃物中的蛋白质
虾废弃物的资源利用
1.虾头酱
虾头酱是虾头加盐发酵后，经磨细制成 的一种粘稠状酱。色浅黄鲜明，质细味香， 盐足水分少，具有虾米的特有鲜味。
2、虾脑油
虾脑油富含脂肪、虾黄质、虾红素和类胡 萝卜素等营养成分。虾味浓郁，可作为食 品工业和家庭用餐的调料。
提取虾废弃物中的蛋白质
提取率=酶解液中蛋白含量/虾壳中粗蛋白的含X100%
护理学青霉素过敏试验操作流程
护理学青霉素过敏试验操作流程英文回答:The penicillin skin test is a diagnostic tool used to determine if a patient is allergic to penicillin or related antibiotics. It involves applying a small amount of penicillin to the skin and observing for any signs of an allergic reaction. Here is the step-by-step procedure for conducting a penicillin skin test:1. Patient Assessment: Before performing the test, the nurse should obtain a thorough medical history from the patient, including any previous allergic reactions to penicillin or related antibiotics. It is important to ensure that the patient is in good health and not currently taking any medications that may interfere with the test results.2. Informed Consent: The nurse should explain the purpose of the test to the patient and obtain informedconsent before proceeding. This is essential for ensuring patient understanding and cooperation throughout the procedure.3. Preparation: The nurse should gather the necessary supplies, including penicillin solution, sterile skin-testing lancets, alcohol swabs, and a marking pen. The test site is typically the forearm, and the nurse should use a grid to mark the test areas.4. Skin Prick Testing: Using a sterile lancet, the nurse pricks the skin and applies a small amount of penicillin solution to the test site. Multiple skin pricks may be performed to test for different types of penicillin allergies.5. Observation: The nurse carefully monitors the test sites for any signs of an allergic reaction, such as redness, swelling, or itching. The reaction is typically observed within 15-20 minutes after the application of the penicillin solution.6. Interpretation: After the observation period, the nurse evaluates the test sites for any allergic reactions.A positive reaction is indicated by the presence of a wheal (a raised, red area) and flare (a surrounding area of redness) at the test site.7. Documentation: The nurse documents the test results, including the presence or absence of allergic reactions, the type of penicillin tested, and any additional observations. This information is important for thepatient's medical record and for informing future treatment decisions.8. Follow-up: Depending on the test results, the nurse may provide appropriate counseling to the patient,including information on avoiding penicillin andalternative antibiotic options if an allergy is confirmed.中文回答：青霉素皮肤试验是一种用于确定患者对青霉素或相关抗生素过敏的诊断工具。
Western-Blot 操作流程及个人心得体会
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）作者：未知时间：2010-5-25 10:26:33Western操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。
平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6. 于4℃下12000rpm 离心5min。
（提前开离心机预冷）7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。
本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）（2）组织中总蛋白的提取：1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。
然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
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POOR
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
方向 正X方向 正Y方向 正Z方向
整车坐标系 参考 从假人面部水平向前，与座椅轨道平行 假人左手方向 垂直向上
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
¾下图：头枕有高度调节时的几何评分位 置，红点为几何评分位置（最低点）。
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IIHS的后碰评分方法
左图：如果 头枕的前后 方向没有锁 止位置，则 以最后点为 几何评分位 置。
首先在座椅上铺一层棉布料，然后在座椅上固定H点假人。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
H点假人安装完毕后安装HRMD，一定要保证HRMD的水平方向。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
Whiplash试验流程
主讲：其力格尔 单位：安全技术开发部
讲座时间:2009年7月20日
人人是老师
人人是学生
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课程大纲
• 第一部分 颈部伤害基本原理
• 第二部分 BIO RIDⅡ假人介绍和后碰评分方法
• 第三部分 EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
高
4.1
低
63
T HRC
中
57
高
53
低
9.4
T1 ACC(g)
中
9.3
10
高
12.5
最低标准 110 190 210 610 750 770 15 24 23 0.35 0.55 0.47 4.4 4.8 5.5 83 82 80 12 13.1 15.9
极限标准 187 290 364 734 900 1024 18.3 27 25.5 0.5 0.69 0.78 4.7 5.2 6.0 95 92 92 14.1 15.5 17.8
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欧洲后碰评分方法
9EURO-NCAP后碰总分为11分，其中2分是几何评分，另外3分是滑台试验 得分。滑台试验分为高强度、中等强度和低强度，每个试验的分数是3分。
3-4分为 1.5-3分为 0-1.5分为
好 边缘 差
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调整好HRMD之后，测 试头枕的水平距离和垂 直距离，需要测试几何 评分和快速调节性。记 录三次几何位置和快速 调节位置。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
¾ 普通头枕几何评分方法：几何评分是静态测试方法，测量头枕与乘员头 部之间的横向距离和上下距离。
EURO-NCAP动态试验中，如果NIC 、NKM、回弹速度、颈部剪切力和 张力中某一项值超出极限标准，那 么该强度滑台试验的分数为零。
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a：低强度
欧洲后碰评分方法
b：中等强度
c：高强度
红线：目标曲线；蓝线：限制线
GOOD
MARGINAL
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欧洲后碰评分方法
静态试验 动态评分 罚分项 最大得分
考察项 HR几何评分
几何调整 低强度滑台 中等强度滑台 高等强度滑台 座椅靠背旋转角度 利用假人弱点
得分 -1至+1
1 3 3 3 -1 -2 11分
EURO-NCAP后碰总分为11分；
后碰分数=（HR评分+几何调整+3个强度分数+罚分项）/11*4
¾IIHS座椅几何试验评分：颈部几何评分，若为Good、Acceptable则需要动态
29实验，若Marginal或Poor则不用做动态试验，整体分数为Poor。
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IIHS的后碰评分方法
¾下图：集成头枕的几何评分位置 ，绿点为几何评分位置。
0mm以上
0-40mm
40mm以内 40-70mm
0至-1 40-80mm 70-100mm
¾ 线性差值方法算分，从Height和Backset里选最差 的分数。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
撤出H点假人和HRMD工具，30分钟后放BIO RID假人，然后对假人各个关节 进行调整，假人头部要比HRMD的BACKSET多出15mm。假人的头部保持水平， 髋部角度为26.5±2.5°。
被动头枕的几何评分方法：汽车制造商需要提供充足的证据，表明在低 强度波形条件下，使用5th女性假人，被动头枕能正常摊开，并且锁止到一 个固定位置，该位置为几何评分位置。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
几何调整（快速调节性）：把头枕的压到最低最后位置，此时进行几何 评分，如果得分大于0分，那么n个前排座椅得到1/n分数，如果两个座椅， 那么能得到1分。
Bio RID Ⅱ通过携带的传感器采集假人的各部位参数， Bio RID Ⅱ假人 的颈部和脊柱骨单独设计，手臂和腿沿用了Hybrid III 50th的零部件，头部是 改进Hybrid III 50th假人头部而成。
Bio RID Ⅱ假人的传感器标准配置： 1）头、胸、脊骨和骨盆加速度传感器 2） Structural replacement for upper and lower neck load cells 3）用户手册里规定的传感器
¾ 试验时头枕的定位方法：
¾EURO-NCAP的头枕定位方法：
1）头枕的调整位置应为头枕几何中部位置。
2）如没有几何中部锁止位置，则向上移10mm，在10mm范围内锁止头枕。
3）如上述两个位置不能满足则向下移动10mm，在10mm范围内锁止头枕。
20 4）如果以上条件都不满足，那么把头枕调整到最下位置。
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Bio RID Ⅱ假人介绍
BioRID Ⅱ（Biofidelic Rear Impact Dummy）假人由瑞典Götenburg科 技大学研发，专门检查座椅和头枕对在后碰时的表现。
Bio RID Ⅱ假人的发展过程：自1999年研发Bio RID Ⅱ假人以来，总共 有七个型号假人被开发。 分别是Bio RID P1、 ASTC-RID、 Bio RID P2、 Bio RID I (A,B and C)、 Bio RID P3、 Bio RID-II和Bio RID-II (ver. A, B and C)。
• 第四部分 IIHS后碰试验方法
• 课程简要回顾
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颈部伤害基本原理
追尾碰撞为例, 简要介绍一下颈部受伤的过程。鞭打伤害是由加速度引起的 机械能传递给颈部所产生的。在追尾碰撞发生时，头部和颈部在惯性力和接触力 的作用下， 当软组织承受的荷载超过极限后， 将会导致颈部伤害的产生。在典 型的追尾碰撞中，最初人体的头部和颈部保持自然状态，颈椎呈现一定的弯曲； 当车辆受到向前加速度时，乘员躯干会受到来自座椅靠背向前的推力，头部和颈 部发生移动, 颈椎伸直；接下来头部相对座椅继续向后移动，上颈椎做弯曲运 动，下颈椎相对于人体躯干做伸张运动，此时的头颈形态呈S形，这一过程同时 伴随着颈椎在垂直方向上的移动，这个方向的运动是由于骨盆的移动及脊柱伸直 动作共同作用而产生的；最后阶段整个颈椎处于伸张状态呈C形。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
先固定落脚点，然后在滑台平台上固定座椅固定支架。 然后把座椅滑轨调整至中间位置，坐垫高度调整至中间位置。
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EURO-NCAP后碰鞭打试验前准备
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Bio RID Ⅱ假人简单介绍
T1 T12
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Bio RID Ⅱ假人简单介绍
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Bio RID Ⅱ假人简单介绍
然后在滑台实验前测一次角度。 滑台试验T-HRC（结束）时间为止，从碰撞录像中观测最大的靠背角度，并 记录发生最大靠背角度的时间。
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IIHS的后碰评分方法
¾IIHS座椅几何评分：根据美国高速公路保险协会（IIHS）公布的数据表明，头后 部和头枕的水平最短距离2-8cm时头枕的表现为G（好），8-10cm时头枕的表现 为A（可接受），10-12cm时M（边缘），12cm以上时头枕表现评为P（不好）。 头顶部和头枕的垂直最短距离2cm至-6cm时头枕的表现为G（好），-6至-8cm时 头枕的表现为A（可接受），-8cm至-10cm时M（边缘），-10cm以上时头枕表现 评为P（不好）。