HEK293FT细胞培养
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
293、293T细胞培养及转染一点经验
qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。
HEK-293T ACE2 细胞稳转株使用说明书
派真生物HEK-293T/ACE2 细胞稳转株使用说明书HEK-293T/ACE2 细胞稳转株HEK-293T/ACE2 细胞稳转株ACE2即血管紧张素转化酶II（Angiotensin-converting enzyme2）是一种Ⅰ型膜蛋白,其包括一个N端肽酶结构域( peptidasedomain,PD)和一个C端 Collectrin样结构域（Collectrin-ikedomain,CLD）。
ACE2的PD为冠状病毒的S蛋白提供了直接结合位点。
冠状病毒因其病毒脂质层外由棘突蛋白） spike protein,S蛋白）构成的冠状突起而得名。
冠状病毒通过S蛋白与靶细胞表面特定受体结合,然后进入细胞复制并引起宿主感染。
冠状病毒的S蛋白包含S1及S2两个亚单位,其中S1包含受体结合域（RBD）,RBD直接与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合,S2负责与宿主细胞膜融合。
当S1与宿主受体ACE2结合时,S2上的裂解位点暴露并被宿主蛋白酶切断,此过程对于病毒感染十分重要。
本细胞系是将ACE2过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。
HEK-293T/ACE2 细胞稳转株产品描述产品名称：中文名称：包装规格：特性蛋白：HEK-293T/ACE2过表达人源 ACE2 的人肾上皮细胞2管（细胞数1E+7个/管）过表达人的血管紧张素转化酶 2 蛋白（ACE2）建议第一次 1:2 传代。
2 天换液10%DMSO +90%完全培养基Puro 嘌呤抗性传代方法: 传代情况：冻存条件：备 注：检测报告：提供感染滴度数据、293T /hACE2感染图片或荧光素酶表达量结果派真生物复苏细胞：将含有2mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。
在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入 10cm 皿中培养过夜，培养过夜。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
293FT人胚肾细胞的培养方法
Parental Cell Lines The 293 Cell Line is a permanent line established from primary embryonal human
kidney transformed with sheared human adenovirus type 5 DNA (Graham et al., 1977; Harrison et al., 1977). The E1A adenovirus gene is expressed in these cells and participates in transactivation of some viral promoters, allowing these cells to produce very high levels of protein. The 293-F Cell Line available from Invitrogen (Catalog no. 11625) is a fastgrowing variant of the 293 cell line, and was originally obtained from Robert Horlick at Pharmacopeia.
Catalog no. 11668-027 11668-019 11965-092 11965-084 16000-036 16000-044 11140-050 25030-081 11360-070 15070-063 25300-054 11811-023 11811-031 10131-035 10131-027 31985-062 31985-070 10010-023 10010-031 15250-061
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HEK293T细胞培养
细胞系的第一步。
细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到
另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消
化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染
梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲
霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色
漂浮物。
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测
镜检有丝状物
细胞污染问题与解决方案
常见的真菌污染
HEK293细胞的复苏
复苏前的准备
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下
将水浴锅预热至37℃
取新培养瓶（75cm2），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM培
养基(37℃预热)，润湿底面
HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化
服传出细胞间外。
进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关 闭状态。
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细胞间的操作注意事项
操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。
试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。
实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、 关闭风机。 凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75% 酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台 使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。 每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入 放入培养箱中继续培养。
HEK293细胞培养心得
HEK293细胞培养心得HEK293细胞是一种来自人类胚胎肾细胞的细胞系，广泛应用于生物医学研究，药物筛选和疫苗生产等领域。
在培养HEK293细胞的过程中，需要注意一些关键因素，如培养基的选择、细胞传代和细胞冻存等。
在我个人的实验室研究中，我积累了一些关于HEK293细胞培养的心得体会，以下是我对HEK293细胞培养的常用操作和一些建议。
首先，关于培养基的选择。
HEK293细胞通常使用DMEM培养基，配合10%胎牛血清（FBS）和1%的抗生素/抗真菌溶液。
在选择FBS时，建议选择FBS批次稳定，比较适合细胞生长的产品，并进行细胞生长曲线的监测。
此外，培养基中的抗生素/抗真菌溶液可以有效地预防细胞培养中的细菌和真菌污染。
其次，细胞传代是保持HEK293细胞健康生长的关键环节之一、一般来说，当细胞达到80%~90%的密度时，可以进行细胞传代。
细胞传代前，应该先用1X磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，然后使用胰酶或胰酶-EDTA溶解细胞。
胰酶处理时间不宜过长，一般5-10分钟即可。
通过观察细胞的形态变化，判断细胞是否已经完全分离，然后将新的培养基添加到细胞生长板中。
注意，传代时的细胞密度不宜过高，否则容易引起细胞凋亡和细胞质重叠。
此外，为了减少细胞传代带来的细胞突变风险，建议每隔一定的时间重新从冻存的细胞中获得新的细胞，而不是一直使用原始细胞系。
另外，一个常见的问题是细胞冻存和解冻。
细胞冻存是保存和传递细胞的重要方法，在培养HEK293细胞时也是常见的操作。
为了成功地冻存和解冻HEK293细胞，我们使用含10%DMSO的冻存液将细胞冷冻在液氮中。
在解冻细胞时，我们将冻存管迅速放入37°C水浴中，轻轻摇晃管子，直到细胞完全解冻。
然后，将细胞转移至预先装有适量培养基的离心管中，并离心以去除残留的DMSO。
最后，将细胞转移至培养皿中，进行正常的培养。
此外，尽管HEK293细胞生长迅速且易于培养，但仍然需要定期检查细胞的健康状态和污染。
HEK293FT细胞培养
293细胞培养293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
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293细胞培养
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：
1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。
细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。
刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。
复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。
换液前宜将培养基预热。
5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。
其它的经验：
1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取
2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，
3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
5、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。
这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。
如果是新的塑料培养瓶就不用处理。
培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3
配置高糖的DMEM培养基1000ml，
1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解
2.加入NaHCO3 2.0g
3.加入谷氨酰胺 0.146g（终浓度为5mM）
4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml）
5.定容900ml
6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中
7.加入灭活小牛血清100ml。