第四章__化学物质成份的鉴定方法
第四章糖类物质的测定
第四章糖类物质的测定第四章糖类物质的测定第⼀节概述⼀、定义和分类碳⽔化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的⼀⼤类化合物，①碳⽔化合物在有机体中的重要作⽤。
糖蛋⽩糖脂－－⽣理功能物质核糖和脱氧核糖－－遗传物质能量来源、结构成分②作为⾷品⼯业的主要原料和辅助材料。
③⼯业发酵的主要碳源，如淀粉、糊精、双糖、单糖。
⼯业发酵过程可以根据糖量的变化判断发酵是否正常；可以根据残糖量确定发酵终点。
糖的分类有效碳⽔化合物——⼈体能消化利⽤的单糖、双糖、多糖(淀粉)。
⽆效碳⽔化合物——不能被⼈体消化利⽤的纤维素、半纤维素、果胶等多糖。
这些⽆效碳⽔化合物能改善消化系统功能，对维持⼈体健康有重要作⽤；纤维素类原料的有效利⽤是⽣物技术中具有挑战性的研究⽅向。
⼆. 糖类物质的分布和含量葡萄糖、果糖: ⽔果，蔬菜：0.96-5.82％，0.85-6.53％蔗糖：⽢蔗，甜菜：10-15％，15-20％；西⽠，菠萝：4％，8％乳糖：动物乳汁，⽜乳～4.7％麦芽低聚糖：异麦芽低聚糖在⾃然界不存在，⽽由淀粉⽔解产⽣低聚果糖、低聚半乳糖、低聚⽊糖：⾃然界少，多由⼈⼯酶法合成淀粉，纤维素，果胶在植物普遍存在三. 糖类物质的测定⽅法分类：直接法：指根据糖的物理化学性质作为分析原理的分析⽅法间接法：根据其它物质含量，⽤差减法计算出来，以总碳⽔化合物或⽆N 抽提物表⽰糖的化学性质—还原性单糖的羰基、酮基、羟基具有不同强度的还原能⼒：醛糖：与弱氧化剂溴⽔：形成糖酸；与较强氧化剂硝酸：醛基和伯醇基都被氧化为羧基，⽣成葡萄糖⼆酸；有时只有伯醇基被氧化成羧酸，形成糖醛酸。
酮糖：酮糖对溴的氧化作⽤没有反应，以此可将酮糖与醛糖分开；在强氧化剂作⽤下，酮糖在羰基处断裂，形成两个酸。
单糖在碱性溶液中，醛基和酮基都可烯醇化为活泼的烯⼆醇，⽽烯⼆醇有还原性，普通酮类则不能。
各种化学分析法⽤于测定可溶性糖总量对各种糖分别定量分析的⽅法⾊谱法：纸⾊谱、薄层⾊谱、GC、HPLC酶电极法、酶⽐⾊法：半乳糖脱氢酶：测半乳糖、乳糖葡萄糖氧化酶：测葡萄糖、蔗糖酶⽔解法：测淀粉含量糖类物质测定的其它⽅法：电泳法：对可溶性糖的分离、定量⽑细管电泳法对低聚糖、活性多糖测定本章重点介绍国内外标准分析⽅法，⼀些有影响的参考⽅法第⼆节可溶性糖类的测定⼀、可溶性糖类的提取和澄清可溶性糖类通常是指葡萄糖、果糖等游离单糖及蔗糖等低聚糖。
第四章 中药制剂的含量测定
EX、ES分别为供试品和对照品溶液的百分吸光系数 注意：仪器和操作条件的控制
3．标准曲线法
配制一系列不同浓度的对照品溶液 （n>5），分别测定吸光度，绘制A-C曲 线或求出回归直线方程（r≥0.999）。 在相同条件下测定供试品溶液的吸 光度，求得供试品中被测成分的浓度或 含量。
氧化还原滴定法
适用于测定具有氧化还原性的物质 如：含酚类、糖类及矿物药Fe、As等成分 的中药制剂。
需严格控制实验条件，且方法的专属性不高（干扰 因素较多）。
滴定分析法的计算
1. 滴定度T 每1mL滴定液所相当的被测物质的重量（mg/mL） aA + bB = cC + dD T= CA ∙ MB ∙ b/a 注意：滴定剂与被测药物的计量关系
适用：
1. 湿法不易破坏完全的有机物；
2. 某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。
不适用：含易挥发性金属（如汞、砷等）
有机药物的破坏
注意事项：
（1）加热或灼烧时，应控制温度在 420℃以下，防止金属化合物的挥发
（2）一定要灰化完全
（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易
溶解，但不要轻易弃去
第二节 常用定量分析方法
液一液萃取法
⒈ 直接萃取法 ：利用被测成分与干扰成分在有机溶 剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到 分离净化的目的。 萃取次数：实验考察（回收率符合） 溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱 选择极性适当的溶剂 水相pH的控制：弱酸性成分 pH≤Ka-2 弱碱性成分 pH≥PKa+2 盐析作用：水相用NaCl饱和，提高提取率。
LSE常用填料 ：
⒈ 硅胶、氧化铝等： 传统吸附剂 不极性吸附作用 氧化铝：用于生物碱、苷类等碱性、中性成分的 测定，吸附酸性成分 硅胶：适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留 碱性化合物。 ⒉ 键合相硅胶： 十八烷基键合相硅胶（C18，ODS）、 C8 ——分离脂溶性杂质或成分 苯基、氰基键合相硅胶 ——分离水溶性杂质或成分
第四章__化学物质成份的鉴定方法
四、未知的植物化学成分的结构分析
未知的植物化学成分，需要通过波谱的综合解析， 还需要配合适当的化学、生物方法（主要是降解） 来进行结构研究。 一般地，要判断一个化合物的准确结构，往往需要 通过多种波谱数据及理化常数相互印证，概括起来 可以从以下几个方面入手：
1、分子量、分子式的确定
由分子式可计算不饱和度，进而推测化合物的大 致类型，如是否为芳香化合物，是否含有双键等。 植物化学成分最可能的分子量、分子式可利用元 素分析、质谱的分子离子峰（M）或其同位素峰 （M+1）、 （M+2）的相对强度来得到。 另外，对于一些高极性或热不稳定的化合物，需 用软电离方式，才有可能得到其质谱的分子离子 峰。
3.比旋光度的测定
有机化合物的结构不对称时，分子与它的镜影 不能相互重叠，而通过它的平面偏振光需偏转一定的 角度，即产生旋光现象。
影响旋光度的因素： a.样品的本质 b.样品的厚度 c.样品的浓度 d.溶剂的温度和波长。
4.比重的测定
估计化合物分子结构的复杂性，凡比重小于1.0 的化合物通常不会含有一个以上的官能团，而含多官 能团的化合物比重大于1。
例如芦丁的甲醇溶液及加入各种诊断试剂后的UV谱如下：
λmax 谱带1 甲醇 甲醇钠 三氯化铝 乙酸钠 259 272 谱带2 359 410
试剂
275 271
OH OH HO A O C
O-Glu-Rha
433 393
强碱，可使所有的羟基解离，进而使谱带1和谱 带2均发生明显红移； 三氯化铝可分别与B环的邻二酚羟基、C环的羰基和A环的 5位羟基形成配合物，也能使谱带1和谱带2均发生明显红 移； 乙酸钠为弱碱，只能是酸性较强的A环7位羟基和B环4位 羟基解离，使谱带1和谱带2均发生明显红移，但若与甲醇 钠。
第四章蛋白质化学第六节蛋白质及氨基酸分离纯化与测定
一、一般原则及基本步骤
材料的预处理及细胞破碎 蛋白质的抽提
蛋白质的粗分级
等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法
蛋白质的细分级
凝胶层析法 离子交换层析法 亲和层析
1
二、蛋白质的分离纯化方法
◇（一）根据分子大小不同的纯化方法 ◇（二）利用溶解度差别的纯化方法 ◇（三）根据电荷不同的纯化方法 ◇（四）利用选择性吸附的纯化方法 ◇（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法
磷酸基
SE-纤维素（强弱酸型）
磺乙基
SP-纤维素（强弱酸型）
磺丙基
常用的阴离子交换剂
离子交换剂
可电离基团
可电离基团结构
AE-纤维素（弱减型）
氨基乙基
PAB-纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸
DEAE-纤维素 （中弱减型）
DEAE -Sephadex （中弱减型）
二乙基氨基乙基 二乙基氨基乙基
DEAE -纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基
（3）有分级分离现象 （4）要求对有机溶剂低温预冷。
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4.温度对蛋白质溶解度的影响
• 在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状 蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外， 例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升 而降低。
• 在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即 失去溶解力。
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保护了 蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定 的胶体溶液。
⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在 双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的 原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。 蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电 层。
化学物质的鉴别
化学物质的鉴别
化学物质的鉴别是指通过一系列的化学和物理性质测试，确定未知物质的组成和特征，以将其与已知的化学物质进行区分和识别的过程。
化学物质的鉴别通常包括以下几个方面：
一、物理性质测试：包括颜色、形状、密度、溶解性、熔点、沸点等物质的常规物理性质测试，这些测试能够提供一些关于物质的基本特征。
二、化学反应测试：通过与已知试剂或物质发生特定的化学反应，检测未知物质的化学性质。
例如，酸碱中和试验、气体生成反应、还原性和氧化性反应等。
三、光谱分析：使用光谱技术如红外光谱、紫外-可见光谱、质谱等，检测物质的分子结构和化学键信息，从而确定其组成和结构。
四、色谱分析：包括气相色谱、液相色谱等技术，通过物质在不同相分离和移动的特性，进行物质的分离和鉴别。
五、其他特殊测试：根据需要，还可以进行其他特殊的化学分析和测试，如热分析、电化学分析、放射性分析等。
通过以上一系列的测试和分析，可以获得关于化学物质的各种性质和特征信息，从而确定其组成和特征，并将其与其他已知化学物质进行区分和识别。
第四章 定量化学分析基础知识
3. 按测定原理(分析方法)分类
化 学 分 析
重量分析
误差E越小，表示测定结果越接近真值，准确度越高；反之，误 差E越大，准确度越低。误差有正负之分，正误差表示测定结果 偏高，负误差表示测定结果偏低。
通常用相对误差RE来衡量测定的准确度，原因是相对误差可反 映测定值与真值之差在测定结果中所占分数，能更合理地反映测 定准确度。举例如下：
[例1] 已知两试样的真实质量分别为：0.5126g和5.1251g。用分析天平称量两试 样，质量分别为：0.5125g和5.1250g。求两者称量的绝对误差和相对误差。
| X1 X 2 | 相对相差= X 1, 2
5）极差和相对极差
极差指一组平行测定结果中最大者与最小者之差。
极差R=Xmax — Xmin；
相对极差=R/X
此法适于说明少数几次测定结果的离散程度。
第四章 定量化学分析基础知识
4.1 分析化学概述
• 4.1.1 分析化学的任务和作用 任务 分析化学是研究获得物质化学组成，结构 信息，分析方法及相关理论的科学，它所 要解决的问题是确定物质中含有哪些组分， 这些组分在物质中是如何存在的，以及各 个组分的相对含量是多少，以及如何表征 物质的化学结构。
( 2) 产生的原因
a.偶然因素 b.滴定管读数
3. 过失误差
4、误差的减免 1）. 系统误差的减免
(1) 方法误差—— 采用标准方法,对比实验 (2) 仪器误差—— 校正仪器
2019_2020学年高中生物第四章生物化学与分子生物学技术实践第一节生物成分的分离与测定技术第1课时蛋白质的
第1课时 蛋白质的分离与提取学习导航明目标、知重点难点掌握电泳法分离大分子的原理。
(重点) 运用常用的方法提取和分离蛋白质。
(重、难点)[学生用书P48]一、阅读教材P 71～72分析蛋白质的分离与纯化 1．生物细胞中的蛋白质提取(1)在提取蛋白质时，可以采用研磨与超声波结合的方法将生物组织或细胞完全破碎，使蛋白质从细胞中释放出来，并使其溶解在适当的抽提液中。
(2)抽提液的选择需要根据蛋白质的特性而定，一般酸性蛋白质用偏碱性溶液抽提，碱性蛋白质用偏酸性溶液抽提，脂蛋白等则可用有机溶剂抽提。
2．蛋白质的分离方法(1)离心沉降法：通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。
(2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离的方法。
(3)凝胶色谱法①概念：根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。
②原理a ．凝胶⎩⎪⎨⎪⎧形态：微小的多孔球体组成：大多由多糖类化合物构成结构：内部具有很细微的多孔网状结构b ．分离的过程进入凝胶颗粒内 部的难易程度路程移动速度小分子 蛋白质 容易较长 较慢大分子 蛋白质无法进入 较短 较快二、阅读教材P73～77完成血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及凝胶色谱法分离血红蛋白的操作1．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳配制试剂→准备器材→架滤纸桥→浸泡薄膜→细心点样→平悬薄膜→实施电泳→染色→漂洗→脱色。
2．凝胶色谱法分离血红蛋白样品处理→血红蛋白的释放、分离和透析→凝胶的制备→色谱柱的装填→样品的加入→洗脱与收集。
判一判(1)酸性蛋白质用酸性溶液抽提，水溶性蛋白质用透析液抽提，脂溶性蛋白质用稀碱性溶液抽提。
(×)(2)电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的过程。
(√)(3)电泳时泳动速度取决于带电颗粒的大小、形状、所带静电荷多少。
(√)(4)离心沉降法和薄膜透析法分离蛋白质的原理是一样的。
(×)(5)凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的大小而对其进行有效分离的方法。
中药化学第四章中药化学成分的分离技术
K=CU/CL CU：上层浓度，CL：下层浓度。 若有两种成份时（A，B），则A，B各有其分
配系数KA，KB，则两者差别越大，分离效果越 好。
如，KA＝10说明振摇一次平衡后，A则有90 ％以上溶于上层溶液中。
而KB＝0.l时，振摇一次平衡后，B则有90％ 以上溶于下层中，过样A和B两成份就有较大程 度分离，连续分离萃取几次，就可能达到A，B 的全部分离。
仪器装置
该装置有3个部分组成。 输液部分。包括微型泵、移动相溶剂储槽和试样
液注射器。 萃取部分。由300～500根内径约2 mm、长度为
20～40 cm的萃取管连接而成。 收集检出部分。包括检出器及分步自动收集仪。
适用范围
目前DCCC法广泛用于皂苷、生物碱、酸性成分、蛋 白质、糖类等天然产物的分离和精制，特别是用于 皂苷类的分离，并取得良好效果。
三、铅盐沉淀法
原理 此法是利用中性醋酸铅和碱式醋酸铅在水和 稀醇溶液中能与许多天然药物化学成分生成 难溶性的铅盐或铅络合物沉淀的性质，使有 效成分和杂质分离。此法既可使杂质生成铅 盐沉淀除去，又可以使有效成分生成铅盐沉 淀。
铅盐沉淀法适用范围
中性醋酸盐(Pb(Ac)2)可用于沉淀天然药物成 分中的有机酸、蛋白质、氨基酸、黏液质、 鞣质、树脂、酸性皂苷、部分黄酮苷、蒽醌 苷、香豆素苷和某些色素等具有羧基、邻二 酚羟基的酸性或酚性物质。
氯仿：乙醚 由 某些苷类，如强心苷
乙酸乙酯
小 某些苷类，如黄酮苷
正丁醇
到 某些苷类，如皂苷，黄酮苷
丙酮、乙醇 大 极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些生物
碱盐
水
蛋白质、黏液质、果胶、糖类、无机盐
（强亲水性）
二、适用范围
此法是早年研究天然药物有效成分的一种最重要的 方法，主要用于分离提纯含有极性不同的各种化 学成分的中药提取液。目前仍是最常用的方法，
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四、官能团的检识
采用红外光谱可以找到某些常见的官能团。并 参照有机定性分析。
五.衍生物的制备
1.制备衍生物的目的
准确确定样品为何种化合物。
2.生成衍生物应具备的条件
a.有固定熔点（50-250C之间且与样品至少相差5C ） b.易于制备，产率高，易精制纯化，试剂价廉易得 c.其物理常数最好文献上有记载，有色谱光谱数据（若是有机
O_
O
OR
-O
+ N
+ N
O_
O
O
第二节 层析鉴定法
一、纸层析
根据移动的位置求出Rf值，进行定性鉴定。 步骤:
a.滤纸选择 b.点样 c.展开 d.定性检定
植物中化学成分多种多样，很多具有特殊的 生理活性，而且结构还很复杂，因此植物化 学成分的结构鉴定一直是化学家感兴趣的研 究领域。
早期的结构研究程序一般先采用多种化学方 法将复杂的分子降解为几个稳定的碎片，然 后通过一些官能团的显色化学反应、理化常 数的测定、元素分析或可通过合成证明的简 单化合物来推测这些碎片分子，最后按降解 反应的原理推到出原化合物可能的结构。
3.比旋光度的测定
有机化合物的结构不对称时，分子与它的镜影 不能相互重叠，而通过它的平面偏振光需偏转一定的 角度，即产生旋光现象。
影响旋光度的因素： a.样品的本质 b.样品的厚度 c.样品的浓度 d.溶剂的温度和波长。
4.比重的测定
估计化合物分子结构的复杂性，凡比重小于1.0 的化合物通常不会含有一个以上的官能团，而含多官 能团的化合物比重大于1。
第四章 化学物质成份的鉴定方法
第一节 化学鉴定法
一、物理常数的测定
分离获得的化合物，首先鉴定属于无机物还是有机物。 结晶性化合物，则需测熔点和比较旋光度。液体测沸点， 比重，折光率等。
1.熔点测定
化合物在大气压力下两态达成平衡而共存时的温度，即熔 点(MP.) 。样品要求：干燥、纯度高。
样品干燥
测定方法 ： a. 比重瓶法 b. U型比重计法 c. 比重天平法
比重的一些规律:
a.烃类比水轻 b.原子被取代则比重增大 c.烷<烯<炔 d.缔合能力越强,比重越大
e.多官能团取代一般比水重
5.折光率的测定
作用：鉴定化合物的纯度，判断可能属于哪类化 合物。
意义：表示光线在真空中与在被测物质中进行速 度的比值。
有机化合物的熔点与分子结构的关系
a.同系列化合物直链的其熔点随分子量增加而增加 b.烃类衍生物熔点比相应烃要高 c.对称性高的比对称性低的熔点要高 d.取代苯中第一，第二类取代基各1时，熔点顺序
为：对位>间位>邻位 e.取代苯中两取代基为同一类取代基时,熔点顺序
为： 对位>邻位>间位 f.氢键的生成对熔点的影响
a. 常压干燥 b. 减压加热干燥 c.干燥剂干燥 d.冷冻干燥 e.红外干燥法
f.真空干燥器抽气法
熔点测定方法
毛细管法：温度计 毛细管 b形管 浓硫酸 或甘油
显微熔点测定仪 优点：a.可测微量样品 b.可测高熔点样品 c.可观察样品加热过程中的变化
熔点测定中的一些问题
a.温度计的较正 b.熔点不敏锐 c.无明显的熔点，易于分解的物质 d.没有固定的熔点但有分解点，软化点 e.复熔现象
物则有，未知物则无）
3.衍生物制备的方法
a.烯烃衍生物的制备 b.芳烃衍生物的制备
c.醇衍生物
d.酚类衍生物的制备
e.醛酮类衍生物
f.糖类衍生物的制备
g.羧酸衍生物的制备
ห้องสมุดไป่ตู้
h.酯类衍生物的制备
i.缩醛衍生物的制备 j.胺类衍生物的制备
3，5-二硝基苯甲酸酯的制备
O Cl
-O
+ N
O
+ ROH
+ N
质谱分析（出现分子离子峰的物质） 混合熔点降低法：
化合物乙与甲混熔，使甲的熔点降低，熔点降低的幅度 与乙的摩尔浓度成正比。
缺点：样品用量大，准确度差
三、化合物功能基和分子骨架的推定
根据该化合物缺氢因素（分子式确定时已知） 推断出双键数或环数，并结合物理常数，化学定性 实验，UV，LR，NMR，MS谱的数据，综合分析，
测定仪器：阿贝折光仪
二、分子式的测定
1.元素定性分析
确定有机物中元素的成分，减少官能团测定步骤，缩小 分析范围，一般只测杂原子。实验室常用钠熔法。
2.元素定量分析
元素分析仪 一般分析C，H，N。
3.实验式的计算
根据元素定量分析数据，确定各元素的组成比。 原子比=百分含量/原子量
4.分子量的测定
具体操作过程：
首先在可见光或紫外光下观察，然后喷以 适当的显色剂或在碘缸中显色，若为单一 斑点，可判断其为纯化合物；
对于个别情况，有时需要用正、反相色谱 加以确认；
在条件允许的情况下，也可利用气相色谱 或高效液相色谱来证实。
二、化合物类型的初步判断
同科属（种）植物研究信息的调研 样品在提取分离过程中的行为 一般理化常数和性质
第三节 仪器分析鉴定
由于科学技术的进步，各种科学仪器的发明 和普及，特别是由于紫外光谱（UV）、红外 光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振谱 （NMR）等近代物理方法的应用，是植物化 学成分结构鉴定的方法发生了革命性的变化， 并已成为植物化学成分结构鉴定的常规手段。
结构研究的程序
化合物纯度的测定和判断 化合物类型的初步判断 已知化合物的结构推断 未知的植物化学成分的结构分析
2.沸点的测定
物质液气两态共存时的温度称为液体化合物的 沸点，每种纯液体都有固定的沸点。
作用：鉴定化合物，判断其化合物的纯度。
常用方法： 毛细管法 蒸馏法
沸点与分子结构的关系
a.同系物化合物随-CH2-增加而增加 b.衍生物的沸点比母体高，其中以羧酸的为
最高。 c.分子的对称性 d.同样在顺反异构体中，顺式的高，反式的低。 e.有机化合物中有缔合现象的沸点升高 f.分子内作用力大小
一、化合物纯度的测定和判断
纯度检查的必要性 植物化学成分结构的准确鉴定必须建立在该 成分分离纯化的基础上，可以说样品的纯 度是能否获得准确信息的关键，否则可能 得到混乱甚至错误的结论。
纯度检查的方法 晶型 熔点 溶程 色泽 色谱方法（薄层色谱和纸色谱）
色谱方法
要求：至少选择在三种溶剂系统中展开