第二节 荧光探针技术基本知识

即荧光的波长要（比所吸收的光的波长）长一些。这一现象
首先由stokes于1852年观察到。荧光探针的stokes位移越大， 其激发光谱和发射光谱的重叠就越小，有利于提高分辨率。
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2. 发射光谱与激发波长无关（Kasha规则） 对同一个荧光化合物而言，在其激发光谱范围内，采用任 一波长进行激发，得到的荧光光谱只会有一个发射带。
平均荧光寿命的计算公式： τ=1/（kf+ΣK）
kf： 荧光化合物的荧光发射速率常数； ΣK：各种非辐射去活化过程的速率常数的总和；
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荧光发射是一种随机过程，只有少数分子其发射是在t =
τ 时发生。荧光衰变属于单指数；衰变过程：有 63%的分子 在t = τ前衰变，而37%在t > τ 的时刻衰变。
旋方向的变化，这时分子即处于激发单重态（singlet excited state ）。如电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的改变，这时 分子具有两个自旋不配对的电子，即S=1，分子处于激发三重 态（triplet excited state），用符号T表示。符号S0，S1，S2分
别表示分子的基态、第一和第二激发单重态； T1 和 T 2 则分别
1. 斯托克斯位移（stokes' shift）
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以波数表示，斯托克斯位移=107（1/λex-1/λem），λex、 λem分别是校正后的最大激波长和最大发射波长（纳米）。文 献出处：Philosophical Transactions of the Royal Society of London (1852) 142: 463-562 从Jablonski 结构图可以发现荧光物质发射的能量明显少 于其吸收的能量，因此荧光产生于较低能量水平，换言之，
to the ground state is spin-allowed and occurs rapidly by emission
of a photon. The emission rates of fluorescence are typically 108s-1, so that a typical fluorescence lifetime is near 10ns(1010-9s).
S1,0
2 1 0
Phosphorescence
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Brief History of Alexander Jablonski : professor Jablonski was born in Ukraine. He received his doctorate in 1930 for work “On the influence of the change of wavelength of excitation light on the fluorescence spectra. ” Although Jablonski left Warsaw Opera in 1926 and devoted himself entirely to scientific work, music remained his great passion until the last days of his life. Throughout the 1920s and 1930s the Department of Experimental Physics at the University of Warsaw was an active center for studies on luminescence under S. Pienkoski. During most of his period, Jablonski worked both theoretically and experimentally on fundamental problems of photoluminescence of liquid solutions. Jablonski’s work was interrupted once again by World War II. In 1946 he returned to Poland to chair a new Department of Physics in the new Nichlolas Copernicus University in Torun. Despite all these difficulties, Jablonski with great energy organized the Department of Physics. Professor Jablonski created a spectroscopic school of which persists even today through his numerous students who now occupy positions at universities in Poland and elsewhere. Professor Jablonski died on September 9, 1980.
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（三）Jablonski Diagram
吸收(Absorption — A): 10-15s； （振动松弛，vibrational relaxation — VR）:10-14-10-12s; 内转换（internal conversion — IC）: 10-12s； 系间窜跃（intersystem crossing — ISC）； 荧光（fluorescence — F）：10-8s; 磷光（phosphorescence — P）：10-5s-several seconds
—— Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz
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（二）基态、激发态、单重态、三重态、激发单重 态、激发三重态
分子都含有不停地运动着的电子。根据量子学理论，运动 着的电子处于一系列不连续的能量状态（即能级），可以从一
个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能 量的吸收和释放。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级 （即基态, ground state）。在一定条件下，电子可以吸收能量 （如光能、电能、热能、化学能、摩擦能等）跃迁到较高能级 （即激发态, excited state），这个过程称为激发。处于激发态 的电子是不稳定的，它总是要跃迁回基态，并将多余的能量释 放出去。跃迁的方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。 以非辐射方式跃迁，能量大多转化为热能。而以辐射方式跃迁， 能量则转化为相应的光，这个过程称为发射（发光）。
Yu、Ys: 待测物质和参比物质的荧光量子产率；Fu、Fs：待 测物质和参比物质的积分荧光强度；Au、As：待测物质和参比 物质对该激发波长的入射光的吸光度。
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Quntum Yield Standards
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7、荧光猝灭（fluorescence quenching） 荧光强度可能由于许多过程的存在而减弱，这种荧光衰减 现象称为荧光猝灭。猝灭可由不同机理而引起。激发态的荧光 体与溶液中的被称作猝灭剂分子相互作用而被去活化，这种猝 灭称为碰撞猝灭。此种情形下，荧光体通过与猝灭剂的扩散碰 撞过程而返回基态，而分子在此过程不发生化学变化。对于碰 撞猝灭，荧光强度的衰减可用著名的Stern-Volmer 方程表示：
表示第一和第二电子激发三重态。
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电子的多重态
hv
Fluorescence
电子跃迁 单重态 （自旋配对） hv
Phosphorescence
激发单重态 （自旋 配对）
单重态 （自旋配对）
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Jablonski diagram illustrating the processes involved in the creation of an excited electronic singlet state by optical absorption and subsequent emission of fluorescence
的数值越大，化合物的荧光越强。不发荧光或发弱荧光的
物质，其荧光量子效率为0或很小。
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绝对荧光量子产率的测量较为困难，通常，荧光量子产率 是通过参比法测量获得。即通过比较相同激发条件下所测得的 积分荧光强度（校正光谱所包括的面积）和对该激发波长的入 射光的吸光度而加以测量。则荧光量子产率可通过下式获得：
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电子所处状态的多重性用M表示（即所处状态的轨道角动 量），M=2S+1。 S为电子自旋量子数的代数和，其值为 0或1。
分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，
即自旋配对的。如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的 该分子体系即处于单重态（或称单线态，singlet state），用
符号S表示。倘若分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自
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5、荧光寿命（fluorescence life time）
荧光寿命与荧光量子效率也许是荧光化合物最重要的 特性参数。荧光寿命（即激发寿命）是指分子在激发态的 平均停留时间。若分子受激发后迅速驰豫，则能实现多次 激发，所以短的荧光寿命可以提高检测灵敏度。大多数荧 光化合物的寿命在纳米级。
长寿命荧光探针—时间分辨荧光技术
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3 . 镜 像 对 称 原 则 （Mirror Image） 如将某种荧光物质的荧 光发射光谱于其吸收光谱相 比较，即可发现这两种光谱
之间存在“镜像对称”关系。 确切的说，是由于 S0 →S1的 吸收光谱而非总吸收光谱呈 现“镜像对称”。例外情况： 三联苯（ terphenyl 环已烷 溶液），蒽（ anthracene , 甲苯溶液）。
formally divided into two categories, fluorescence and
phosphorescence, depending on the nature of the excited states.