胰蛋白酶的分离纯化
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磁性亲合分离法纯化胰蛋白酶
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胰蛋 白酶 （ ｒｐ ｉ， Ｃ３ ２ ．）是一种 蛋 白水解 Ｔｙ ｓ Ｅ ． １ ｎ ４ ４ 酶（ｒｔ ｓ） Ｐｏ ａｅ，具有 蛋 白水解 酶的通性 。胰 蛋 白酶的专 ｅ
一
能共价键 结合亲和 配基 ，还 因具有磁性 ，在 外加磁场 的作用 下，进行快速 运动或分 离， 因而 引起众 多研究 人员 的广泛 关注Ｌ 。 ２ 本文采用 简单、 易行 的方法，制备 出具活性 基团的 高磁性 壳聚 糖微粒 、共价 偶联抑肽 酶 ，应用于胰 蛋 白 酶的亲和纯化 ， 纯化倍 数为 １ ２ 活 性回收率为４ ． ．， ７ １ ２％， 实验结果表 明，高磁性壳聚糖微 粒可用作亲和 吸附剂 。
胰蛋 白酶 （ ｒｐ ｉ， Ｃ３ ２ ．）是一种 蛋 白水解 Ｔｙ ｓ Ｅ ． １ ｎ ４ ４ 酶（ｒｔ ｓ） Ｐｏ ａｅ，具有 蛋 白水解 酶的通性 。胰 蛋 白酶的专 ｅ
一
能共价键 结合亲和 配基 ，还 因具有磁性 ，在 外加磁场 的作用 下，进行快速 运动或分 离， 因而 引起众 多研究 人员 的广泛 关注Ｌ 。 ２ 本文采用 简单、 易行 的方法，制备 出具活性 基团的 高磁性 壳聚 糖微粒 、共价 偶联抑肽 酶 ，应用于胰 蛋 白 酶的亲和纯化 ， 纯化倍 数为 １ ２ 活 性回收率为４ ． ．， ７ １ ２％， 实验结果表 明，高磁性壳聚糖微 粒可用作亲和 吸附剂 。
永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究
郭瑞 华 ，王和平 ，刘正猛 ，翟 丽 ，吴少杰 ， 段姣姣 ， 王 宝
（ 华北 煤炭 医学 院 ，河北 唐 山 ０ ３０ ） ６００
摘要： 目的 从豆豉 中 提取胰蛋白酶抑制剂， 并探讨其降血糖活性。方法 以永川豆豉为材料， 经脱脂， 酸性溶液提取， 硫
酸 铵 沉 淀 得 到 胰 蛋 白酶 抑 制 剂 粗 提 物 ， 经 Ｓｐ ａｅ ７ 再 ｅｈｄｘＧ一 ５凝 胶 层 析 得 到 纯 化 的胰 蛋 白酶 抑 制 剂 ， 纯化 的 胰 蛋 白 酶抑 以
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（ 华北 煤炭 医学 院 ，河北 唐 山 ０ ３０ ） ６００
摘要： 目的 从豆豉 中 提取胰蛋白酶抑制剂， 并探讨其降血糖活性。方法 以永川豆豉为材料， 经脱脂， 酸性溶液提取， 硫
酸 铵 沉 淀 得 到 胰 蛋 白酶 抑 制 剂 粗 提 物 ， 经 Ｓｐ ａｅ ７ 再 ｅｈｄｘＧ一 ５凝 胶 层 析 得 到 纯 化 的胰 蛋 白酶 抑 制 剂 ， 纯化 的 胰 蛋 白 酶抑 以
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胃蛋白酶
pH
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
50g
加入
5
倍体积预冷的
pH2.5
乙酸酸化水
用组织捣碎机捣碎
离心
10000 rpm
，
15 min
用
4
层纱布过滤得上清液（
收集约
1.5 mL
，作为留样
1
，测蛋白含量，及时
SDS
化）
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
0.1 mol/L CaCl
2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
），轻轻搅拌均匀
用
5 mol/L NaOH
调
pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
2.5 mol/L H
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
）混匀，
用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
8
％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
M
Tris
－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
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加入
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用组织捣碎机捣碎
离心
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，
15 min
用
4
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收集约
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1
，测蛋白含量，及时
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将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
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2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
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用
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pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
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3
C
6
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5
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7
·
2
H
2
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用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
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％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
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－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化
盐析 、等 电点沉 淀和 Ｄ Ａ — ｅｕｏｅ ３ Ｅ Ｅ Ｃ ｌ ｌｓ一 ２离子 交换层
总 厂 ；Ｕ １０ Ｔ 一 ８ ０紫外 可见分光光度计 ： 北京普 析通用仪 器 有限责任公 司 ；２ 分 光光度计 ： ７１ 上海第 三分 析仪 器 厂 ； Ｇ ． Ｌ Ｊ ５冷冻 干燥 机 ：北京 四环科 学仪器 厂生产 ； ０ Ｄ Ｃ 一４ Ｙ Ｚ ２ Ｄ电泳 槽 ：北 京六 一仪 器 厂 ；００５ ０ｐｗ ｒ １０ １０ ｅ ｏ ｓｐ ｌ ｕ ｐｙ电泳仪 电源 ： ｉ— ａ 司 ；８ ３ — Ｖ紫外 检 Ｂｏ Ｒ ｄ公 ８２Ａ ｕ 测仪 ：北京市新技术 应用研究所 ； Ｌ２ Ａ全 自动 高速 Ｇ ０ 冷 冻离心机 ： 湘西仪器仪表总厂机械仪器厂 。
摘
要： 采用盐析、 电点沉 淀、 Ｅ Ｅ Ｃ ｌ ｌｓ一 ２离子 交换柱层 析纯化 大豆胰蛋 白酶抑 制剂 ， 等 Ｄ Ａ — ｅ ｕｏｅ ３ ｌ 电泳测定其相 对分
子量 为 ２ ． ｋ ， Ａ Ｅ 苯 甲酰一 － ０１ ｕ Ｂ Ｅ （ Ｌ 精氨 酸 乙酯） 法测定抑制 比为 ０ ：。纯化后的 Ｓ Ｔ（ ．１ ９ Ｂ Ｉ大豆胰蛋 白酶抑制荆 ） 可以作
ａｆ ｉｙｃ ｒ ｍａｏ ａ ｈ ． ｆ ｎ ｔ ｈ ｏ ｔ ｇ ｐ ｙ ｉ ｒ
Ｋｅ ｙｗｏｒ ｓ：ｏ ａ ｙ ｐ ｉ ｎ ｉ ｉ ｒ ＤＥＡＥ－Ｃｅｌ ｏ ｅ ２；ｎ ｂ ｔｒ ａｉ ｄ ｓ ｙＢｅ Ｔｒ ｓｎ Ｉ ｈ ｂｔ ； ｎ ｏ ｌｕ ｓ －３ ｉｈｉｉ ｙ ｒ ｔｏ ｌ ｏ
维普资讯
科 研 学究
食品研究与开发
第０第月 ２８ ４ ２ 期 ０年４ ９ 卷
３ ＝＝ ９ －
大豆胰蛋 白酶抑制剂的分离纯化
武金霞 １ Ｉ １ 吴娅平 ’ 学敏 韩丽梅 ’ ＂ ， 杜 ， （ ．河北大学生命科学学 院 ， １ 河北 保定 ０ １０ ；． ７０２２ 石家庄 高等医学专科学校冀联校 区， 河北 石家庄 ０ １０ ） ５０ ０
总 厂 ；Ｕ １０ Ｔ 一 ８ ０紫外 可见分光光度计 ： 北京普 析通用仪 器 有限责任公 司 ；２ 分 光光度计 ： ７１ 上海第 三分 析仪 器 厂 ； Ｇ ． Ｌ Ｊ ５冷冻 干燥 机 ：北京 四环科 学仪器 厂生产 ； ０ Ｄ Ｃ 一４ Ｙ Ｚ ２ Ｄ电泳 槽 ：北 京六 一仪 器 厂 ；００５ ０ｐｗ ｒ １０ １０ ｅ ｏ ｓｐ ｌ ｕ ｐｙ电泳仪 电源 ： ｉ— ａ 司 ；８ ３ — Ｖ紫外 检 Ｂｏ Ｒ ｄ公 ８２Ａ ｕ 测仪 ：北京市新技术 应用研究所 ； Ｌ２ Ａ全 自动 高速 Ｇ ０ 冷 冻离心机 ： 湘西仪器仪表总厂机械仪器厂 。
摘
要： 采用盐析、 电点沉 淀、 Ｅ Ｅ Ｃ ｌ ｌｓ一 ２离子 交换柱层 析纯化 大豆胰蛋 白酶抑 制剂 ， 等 Ｄ Ａ — ｅ ｕｏｅ ３ ｌ 电泳测定其相 对分
子量 为 ２ ． ｋ ， Ａ Ｅ 苯 甲酰一 － ０１ ｕ Ｂ Ｅ （ Ｌ 精氨 酸 乙酯） 法测定抑制 比为 ０ ：。纯化后的 Ｓ Ｔ（ ．１ ９ Ｂ Ｉ大豆胰蛋 白酶抑制荆 ） 可以作
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科 研 学究
食品研究与开发
第０第月 ２８ ４ ２ 期 ０年４ ９ 卷
３ ＝＝ ９ －
大豆胰蛋 白酶抑制剂的分离纯化
武金霞 １ Ｉ １ 吴娅平 ’ 学敏 韩丽梅 ’ ＂ ， 杜 ， （ ．河北大学生命科学学 院 ， １ 河北 保定 ０ １０ ；． ７０２２ 石家庄 高等医学专科学校冀联校 区， 河北 石家庄 ０ １０ ） ５０ ０
酶的分离纯化过程中要注意什么问题
酶分离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133 组别：第六组姓名：董冰夏学号：2013013906酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
因为酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部 分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第1页
1 内容摘要 亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过 程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因 影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶 性固体载体共价结合， 形成含有高度专一性亲和吸附剂。 以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对 性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第4页
1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第2页
本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第1页
1 内容摘要 亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过 程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因 影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶 性固体载体共价结合， 形成含有高度专一性亲和吸附剂。 以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对 性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第4页
1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第2页
本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
青鱼胰蛋白酶的分离纯化及部分性质研究
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安徽农 业科 学 ． ｕ ａ ｏ Ａ ｈ ｉ ｇｉＳ ｉ２ ０ ，６ １ ）４ ４ — ５ ３ ４ ４ Ｊ ｒ ｌ ｆ ｎ ｕ Ａ ｒ ｃ ０ ８ ３ （ １ ：５ １ ４ 叶
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胰凝乳蛋白酶的制备(生物分离纯化技术课件)
胰凝乳蛋白酶的制备
生产实训
2、胰凝乳蛋白酶分离：取提取液10mL，加固体(NH4)2SO41.14g达 0.2饱和度，放置10min，离心(3000r/min)10min。弃去沉淀，保留上清 液。在上清液中加入固体(NH4)2SO41.323g达0.5饱和度，放置10min离心 (3000r/min)10min。弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶解于3倍体积的水 中，装入透析袋中，用pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液透析，直至 1%BaCl2检查无白色BaSO4沉淀产生，然后离心(3000r/min)5min。弃去 沉淀(变性的酶蛋白)，保留上清液。在上清液中加(NH4)2SO4(0.39g/mL) 达0.6饱和度，放置10min，离心(3000r/min)10min。弃去上清液，保留 沉淀（即为胰凝乳蛋白酶）。
胰凝乳蛋白酶的制备 实训试剂与设备 二、实验器材 高速组织捣碎机，解剖刀，镊子，剪刀，烧杯（50mL、100mL），离 心机，离心管，漏斗，纱布，棉线，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、 0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，台秤，分析天平，离心机。
胰二、生产操作
胰凝乳蛋白酶的制备
实训目标 1.掌握盐析法分离酶的基本原理和操作； 2.掌握结晶的基本方法和操作； 3.学习胰凝乳蛋白酶制备的方法。
胰凝乳蛋白酶的制备
实训原理 蛋白质分子表面带有一定的电荷，因同种电荷相互排斥，使蛋白质分 子彼此分离；同时，蛋白质分子表面分布着各种亲水基团，这些基团与水 分子相互作用形成水化膜，增加蛋白质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶 液中加入大量中性盐，蛋白质分子表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏， 于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出，这种现象称为盐析。由于不同的蛋 白质分子表面所带的电荷多少不同，分布情况也不一样，因此不同的蛋白 质盐析所需的盐浓度也各异。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混 合液中的各个成分分步析出，达到粗分离蛋白质的目的。
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胰蛋白酶分离纯化路线
胰蛋白酶纯化
采用离子交换层析 原理：蛋白质在其等电点以下时带正电荷，可以被阳离子交换树脂所 吸附；而蛋白质在等电点以上，带负电荷，可以被阴离子交换树脂所 吸附。 因为胰蛋白酶等电点为10.1且在酸性条件下稳定，所以功能基团考虑 使用阳离子 此外，遵循大分子物质分离一般采用弱性，因此使用弱酸性阳离子， 骨架材料选择凝胶，因为其孔度大，亲水性好。 离子交换剂的离子形式考虑用盐型。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤 性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。 喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。 还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
胰蛋白酶分离纯化路线
胰蛋白酶粗提液的获取
1.将胰脏绞碎成胰浆，在5~10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。 2.3500r/min 下离心20min，取上清液用二层纱布过滤，然后根据 等电点沉淀的原理用稀硫酸将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左 右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。 3.采用透析袋透析，然后用硫酸铵盐析法将胰蛋白酶从粗提液中沉 淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（透析袋透析原理：由于 膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液中的小分 子溶质透向透析液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧， 经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。）
胰蛋白酶分离纯化路线
离子交换层析法纯化胰蛋白酶
离子交换柱 恒流泵
部分收集器ຫໍສະໝຸດ 离子交换流程简图胰蛋白酶分离纯化路线
工艺流程：粗提液的获取
胰蛋白酶分离纯化路线
工艺流程：纯化
• 羊胰蛋白酶与牛、猪的相似，但其活力略高于牛和猪的。
胰蛋白酶的功效
为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨 酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋 质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、 血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化， 促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。
• 牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成，含6对二硫键，其氨基酸排列顺序和晶体结构
已被阐明。在肠激酶活自身催化下，酶原的N末端赖氨酸与异亮氨酸残基之间的肽 键被水解，释放出来缬-天-天-天-天-赖6肽，生成有活性的胰蛋白酶。牛的胰蛋 白酶氨基酸残基223个，分子量23800。
• 猪胰蛋白酶的化学结构与牛胰蛋白酶十分相似，在氨基酸残基排列顺序中，只有
41个氨基酸残基不同，但分子构型有很大区别。沉降系数S20W为2.77S pI=10.8， 热稳定性较牛胰蛋白酶稳定，Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显，无螯合Ca2+ 的中心部位。有6对二硫键，断裂1~2个键，均不至于破坏酶分子的完整结构而保 护了酶的活性。酶的活力分别相当于牛的72%及羊的61%。
胰蛋白酶的分离纯化
主要内容
• 胰蛋白酶的结构、理化性质 • 胰蛋白酶功效
• 分离纯化路线
胰蛋白酶结构及理化性质
• 胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取，纯化获得的结晶，再制成的冻干制剂。易
溶于水，不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时间煮沸几乎 不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶的等电 点为pH10.1。