第六章质粒(参考)
质粒图谱大全
（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
分子生物学-课件-分子生物第六章可编辑全文
• 使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度 (Tm)、变性温 度、熔点
• DNA的解链温度一般在82-95℃ ，与DNA的分子大小和碱基组成、 溶液的pH值和离子强度（+）等有关
二、复性
• DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新 形成互补双链结构
且RNA的完整性和纯度都很高
3、氯化锂-尿素法
• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA 酶，氯化锂选择性沉淀RNA
• 缺点：存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会 丢失一些小分子RNA，如5sRNA等
• 优点：快速、简便、产量高，尤其适用于大 量样品少量组织细胞的RNA提取
4·热酚法
• 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和SDS等联合使用，可以快速裂 解细胞，解离核蛋白复合物，释放RNA，并有效抑制 RNase的活性
• 在某些理化因素的作用下，维 系核酸二级结构的氢键和碱基 堆积力受到破坏，DNA双螺旋 结构松散，变成单链的过程称 为核酸的变性
• 核酸双螺旋区的氢键断裂，变 成单链，但并不涉及共价键的 断裂
DNA解链曲线
DNA变性的本质是氢键的断裂
核酸的变性因素
• 变性方法
–热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、 尿素和甲酰胺 ）
(3)煮沸裂解法
• 以溶菌酶、Triton裂解细菌，然后以沸水浴加热，不 仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体DNA、质 粒DNA变性
• 当降低温度时，闭环质粒DNA复性留在上清液中，而 染色体DNA保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过 离心除去
• 在离心上清液中加入有机溶剂 (例如异丙醇)便得到质 粒DNA粗品沉淀
质粒的基本知识
质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。
这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
质粒构建课件
Digestion & ligation
PCR product or vector Enzyme 1 Enzyme 2 10XBuffer 100XBSA(?) ddH2O
37°C 2~3 h
PCR product Vector T4 DNA ligase 10Xligase buffer ddH2O
pCS2(GFP)
……
/vectordb/
Gene cloning
Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion & ligation Transformation & Identification
AAT TCG AAG
CGG TG
EcoR I/BamHI digestion
BamH I GAT CCA CCG
GFP
G AAT TCG AAG
insert
CTT CG A ATT C
GCG GAT CCA CCG
CGG TGG ATC CGC
GFP
Gene cloning
Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion & ligation Transformation & Identification
质粒构建
孟庆明 2019-04-09
1
1
主要内容
质粒的概念及特点 质粒构建的基本步骤和原理
一、质粒的概念
载体（vector;carrier;vehicle） 可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行 独立和稳定的自我复制的核酸分子。基因工程中广泛应用的载体多 来自人工改造的细菌质粒、噬菌体或病毒核酸等。多数载体是DNA 分子，但某些RNA分子也能用做载体。
第六章细菌的遗传与变异
第六章 细菌的遗传与变异
第二节 基因突变
二、细菌变异的类型
抗性变异
是对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异。例 如培养枯草杆菌或蜡样芽孢杆菌于含少量青霉素G的 培养基中时，可诱导这些细菌产生青霉素酶以破坏 青霉素。
营养型变异
1． 主要引起营养缺陷变异，即细菌丧失合成一 种或几种生长因子的能力，无法在基本培养基上正 常生长繁殖的变异类型。如变异株丧失对某种糖类、 维生素、氨基酸或其他生长因子的合成能力，在补 充这些营养物质的培养基上才能生长。
第六章 细菌的遗传与变异
第四节 细菌遗传变异研究的意义
一、理论方面 二、实践方面
基因工程
基因工程是用人工方法将所需要的 某一供体生物的DNA大分子提取出来，在离 体的条件下用适当的工具酶切割，把它与 作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体 一起导入某一易生长、繁殖的受体细胞中， 让外源遗传物质在其中“安家落户”，进 行正常的复制和表达，从而获得新的产物。
第六章 细菌的遗传与变异
第一节 细菌遗传变异的物质基础
二、质粒
转座因子
可移动的DNA片段称为转座因子。细菌的转座因子有 三种类型：插入序列、转座子以及某些特殊的噬菌体。
毒力岛
PAI是指病原菌的某个或某些毒力基因群，分子结构与功能有 别于细菌染色体，但位于细菌染色体之内，因此称之为“岛”。 PAI虽然是染色体的DNA片段，但两端往往具有重复序列与插入 元件，其G＋Cmol%及密码使用与细菌染色体有明显差异，分子 量较大，多为30到40kb，也有达100kb者。
第六章 细菌的遗传与变异
第二节 基因突变
三、诱发细菌变异的方法
物理方法
包括温度及各种射线。温度诱发基因突变的机制 似乎是专一对GC碱基对的作用。辐射的诱变作用一般 认为有直接作用和间接作用两个方面。
《质粒和噬菌体》课件
根据质粒的用途可分为抗生素抗性基因质粒、代谢缺陷型质粒、温度敏感型质粒等 。
02
质粒的复制和传播
质粒的复制
自主复制
质粒能够独立于宿主染色体进行复制，并保持稳定的遗传特性。
复制起点
质粒复制起始于特定的DNA序列，称为复制起点或Ori。
复制酶
质粒复制需要特定的复制酶，这些酶能够识别并催化Ori序列，启动DNA复制。
自我复制
噬菌体在宿主细胞内复制 增殖，最终导致宿主细胞 裂解，释放出子代噬菌体 。
无独立生活能力
噬菌体没有独立的代谢和 能量转化能力，只能在宿 主细胞内才能进行正常的 生命活动。
噬菌体的种类
根据基因组的不同，噬菌体可以分为 DNA噬菌体和RNA噬菌体两大类。
根据形态的不同，噬菌体可以分为蝌 蚪形、微球形、丝形、棒形等不同类 型。
生物信息学研究
质粒和噬菌体的基因序列 可用于生物信息学分析， 研究基因组学、进化关系 等生物学问题。
THANKS
感谢观看
质粒复制和传播的机制
复制与传播的关联
质粒复制和传播机制密切相关， 复制酶在复制过程中也参与质粒
的传播。
接合作用
在转化过程中，质粒DNA通过细 菌的膜通道进入受体细胞，与受体 细胞染色体整合或独立复制。
重组与整合
在转导过程中，质粒DNA与噬菌体 DNA发生重组，通过噬菌体的感染 和整合酶的作用，将质粒DNA整合 到受体细胞染色体中。
04
噬菌体的复制和生命周期
噬菌体的复制周期
侵入
噬菌体通过融合、出芽或注入 等方式将遗传物质注入宿主细 胞内。
组装
新的噬菌体DNA与蛋白质外壳 结合，形成完整的噬菌体粒子 。
分子生物学-质粒
lacZ'
拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
pUC18
2686 bp Apr
ori
表达型质粒载体的结构
质粒
17 2013-11-9
常用克隆载体
类型：T-载体，pUC系列，pMD系列，一些 表达型质粒 特点：功能单位小，拷贝数多
质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因
低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因
温敏质粒 测序质粒 整合质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合
cccDNA
离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA 用无DNase的RNase去除残余的RNA
mob 基因决定
携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
质粒的基本知识
质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。
这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
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如F质粒，每个细胞中只有1-2个拷贝，它们的复制受到严 格控制，属于严谨型质粒或低拷贝质粒。
另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质 粒。通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。
第六章 质 粒 (plasmid)
质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能染色体上，又可以游离于染色体外（附加体） b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closed
circular DNA，简称cccDNA)， c、分子大小范围从l kb左右到1000 kb。
70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广 泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微 生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒 的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。
二、质粒的命名原则
质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和 性差异划分为不同的类型。
最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名， 如F因子(fertility factor，致育因子)、R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒) 等。
大小（kb） 95-100 54 80 98 90 21 25 9
83
2 56 200 230 56 75
拷贝数 1-3 1-3 1-3 1-3 1-3
10-30 10-15
宿主 大肠杆菌, 沙门氏菌, 柠檬酸杆菌
假单胞菌和其它G阴性菌
G阴性菌 大肠杆菌, 奇异变形杆菌 大肠杆菌, 志贺杆菌, 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 粪肠球菌 大肠杆菌 志贺杆菌 阴沟杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 根癌农杆菌 假单胞菌 假单胞菌 恶臭假单胞菌 假单胞菌 根瘤菌
自20世纪80年代中期以来，在链霉菌、酵母、丝状真菌等 微生物中都发现了线状DNA质粒，甚至还有RNA质粒。
质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予 宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。
如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应药物或 化学毒物的环境中生存。
质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予 宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境 密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物 结瘤、固氮、对有机物的代谢等。
控制拷贝数的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相 互作用的结果。
质粒大小和类型
类型 致育因子 R质粒
Col质粒 毒性质粒
代谢质粒
代表质粒 F因子 RP4
R1 R6 R100 pSH6 pAD2 ColE1 ColE2 ColDF13 Ent（P307） K88质粒 ColV-K30 pZA10 Ti CAM SAL TOL pJP4 pSym
表型特征 性纤毛、接合转移 性 纤 毛 、 接 合 转 移 ， 抗 Ap 、 Km、Nm、Tc 抗Ap、Km、Su、Cm、Sm 抗Km、Nm、Su、Cm、Sm Cm, Sm, Su, Tc, Hg Gm, Tm, Km Em, Sm, Km 产大肠杆菌素E1 产大肠杆菌素E2 产大肠杆菌素DF13 产肠毒素 粘附抗原 摄铁载体, 免疫机制抗性 肠毒素B 诱导肿瘤 樟脑降解 水杨酰降解 甲苯降解 2,4-二氯苯乙酰降解 共生固氮
二、 质粒的复制
复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复 制子，每一个质粒也是一个复制子。
一、质粒的发现
大肠杆菌的F因子是第一个被发现(1946年)的细菌质粒， 它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。
日本学者(1957年)报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导 抗生素抗性的转移现象。在以后的20多年中，陆续发现各 种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性 和药物抗性的范围。
编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒， 如pUC18和pUC19等。
第二节 质粒的遗传特征
一、 质粒的大小和拷贝数
质粒的大小：以分子质量MD或碱基对数kb表示，1MD的双 链DNA=1.65kb。质粒的大小一般在1-200kb，最大的可达 1400kb(如苜蓿根瘤菌质粒pRm141a)。
随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物 新类群和新质粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文 献中质粒名称的混乱。直至1976年Novick等才提出一个可 为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。
其规则是：
质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字 母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现 者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。
在基因工程和分子生物学的发展过程中，质粒也起着非常重 要的作用。以质粒为载体进行的基因克隆技术，在原核生物 和真核生物中表达外源蛋白的方法和技术已在工、农、医各 个领域中得到广泛应用。
因此，对质粒的研究无论在理论上或应用上均具有十分重要 的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。
第一节 质粒的发现和命名
分子量小的CoLEl质粒，每个细胞中有10-100个拷贝， 它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。
含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂 受到抑制，染色体DNA也停止了复制，但所含的ColEl质粒 可持续复制10~15小时，直到每一个细胞中含有1 000~3 000个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一 类型的质粒。
质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的 质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。
质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也 可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数 与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子 质量小的拷贝数高。
质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringent plasmid） 和松弛型质粒（Relaxed plasmid）。