实验动物微生物学分类及控制共75页文档
微生物实验
微生物学实验实验一一、目的要求二、基本原理➢➢➢三、实验材料每组同学需要准备以下材料（2人/组）：●●●●●●●●●●●●●●四、实验内容（一）、培养基的配制：注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。
操作图示：四、实验内容培养基配方：1．配制肉汤斜面培养基50 mL 2．配制麦芽汁斜面培养基3．注意事项：◆◆◆◆（二）培养基灭菌四、实验内容（三）包扎1．培养皿：2．吸管：3．三角玻扒：五、实验报告思考题：◆◆◆◆◆◆◆◆实验二一、目的要求➢➢二、基本原理三、实验材料1．各组所需的物品●●●●2．注意事项：①②①②③④四、实验内容1．微生物的斜面接种技术：斜面接种的操作方法：转下页接种菌名及接种划线方式、接种工具：细菌：霉菌：酵母菌：图2-1 各种无菌操作接种技术示意图图2-2 穿刺接种操作过程示意图2．生物的培养技术——培养箱恒温培养法3. 为下次实验准备平板培养基：注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。
培养基配方：(1)配制肉汤平板培养基100 mL(2)配制麦芽汁平板培养基配制好的培养基进行灭菌！五、实验报告1．观察记录实验结果:微生物琼脂斜面上的生长状况。
2．思考题:◆◆实验三一、目的要求●●二、基本原理三、实验材料1、各组所需物品：•••••2、平板的制备：四、实验内容1. 平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌（3皿）图3-1 混合倒平板操作法示意图四、实验内容2. 平板划线分离法：（3皿）图3-2 平板划线分离操作法示意图图3-3 平板划线菌落分离效果图四、实验内容3. 平板涂布分离法(3皿)：图3-4 涂布平板操作法示意图四、实验内容4. 平板点殖：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3皿）四、实验内容5. 生物的培养技术：培养箱恒温培养法➢➢五、实验报告1、观察记录实验结果：微生物的菌落特征注:菌落特征描写方法参考如下：五、实验报告2、思考题:实验四一、目的要求二、基本原理转下页二、基本原理三、实验材料1. 菌种：2. 每组制片用具：3. 染色剂1套：四、实验内容四、实验内容3.细菌、酵母菌、霉菌的制片技术及个体形态观察：●●●图4-10 涂片制备过程四、实验内容4 注意事项：●●●●。
微生物知识卫生管理
固体制剂
痢疾等
糖浆等药剂
发酵、发霉等
乳化剂 乳剂
有沉淀物、悬浮物、产生恶 臭
变色、带色、分离
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微生物对药品的危害
药品微生物污染引起的病症实例：
1964年瑞典报道两名患者使用绿脓杆菌感染的眼 膏而失明。
1965年英国陆续报道氯已啶抗液由于绿脓杆菌的 污染，使7人患尿道感染；气管内导管使用的利多 卡因药膏由于污染使4人肺部感染。
土壤中的菌数(千个/g) 2500000 15000 700 400
广东砖红壤
微生物类群
土壤中的菌数(千个/g)
细菌 放线菌 真菌
5070
390
5
110
微生物
微生物的特性： 新陈代谢旺盛，繁殖速度快；
一般细菌每20-30分钟即可繁殖一代，由一个变成 两个。若30分钟分裂一次，一昼夜繁殖的个体则为 247即140万亿个细菌。
*大多数的有机防腐剂和消毒剂，除季胺类抗菌剂外， 可被细菌或真菌分解而失效，甚至在低于使用浓度时， 沿可被微生物作营养物利用，如新洁而灭。
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微生物对药品的危害
由微生物污染引起的ຫໍສະໝຸດ 剂变质和危害 （内服药片和药水）药剂分类
肉眼所能见的变质现象
使用中的 主要危害
药片、胶囊剂等 溃散、变色、带色、发霉等 感染症和
药品生产人员的身体健康状况应符合一定的标准； 药品生产人员应穿戴与所从事作业相适应的防护
服装； 药品生产人员在生产区内，尤其是洁净区内，应
工作仔细而且要自我约束。
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生产人员卫生
个人健康：制药企业药品生产人员， 尤其是与药品直接接触的人员，其 健康状况如何，将可能直接或间接 威胁药品质量。这主要从以下三个 方面进行控制
实验动物微生物学分类与控制
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第一节 实验动物微生物学控制
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一.实验动物微生物质量控制的原因
实验动物如受到病原微生物、寄生虫的污染， 其正常状态的平衡将遭致破坏，引起动物发病， 从而给动物的生产及实验的正常进行带来严重影 响。有的不立即发病，但处于可能发病的污染状 态，即机会致病因子的潜在性感染时，如再施加 做为附加因素的实验处理，动物可能发病。
生长率：无菌禽类>普通禽类 ；无菌大小鼠≈普 通大小鼠 无菌豚鼠、家兔<普通豚鼠、家兔
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繁殖率：规律同生长率 代谢：血中含氮量少，肠管对水的吸收率低，代
谢周期比普通动物长。 营养：无菌动物体内不能合成VB和VK，易发生
缺乏症。 抗辐射能力：无菌动物能力强于普通动物，无菌
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（二）生理学改变
免疫功能：由于网状内皮系统、淋巴组织发育不 良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生γ-球蛋白的 能力很弱。血清中IgM、IgG水平低，免疫功能 处于原始状态，应答速度慢，过敏反应、对异体 移植的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。 用低分子无抗原饲料饲喂无菌动物时，血清中几 乎不存在γ-球蛋白和特异性抗体。
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随着现代科学的发展和西方动物保护主 义运动的影响，实验动物科学已从过去注 重于动物的饲养管理和实验操作，愈来愈 集中于动物的福利和实验结果的质量。实 验动物使用总量下降，高质量实验动物使 用量增加。
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小鼠抗实验性烫伤引起的休克死亡能力也强于普 通小鼠。 寿命：无菌动物>普通动物
微生物控制分类 实验动物
• 层流架 • 层流架带有空气净化装置和通风系统，置于普 通房间内，可作清洁级动物短时间饲养或实验 操作及实验后的观察等使用，如果放置在清洁 级房舍内，可用作SPF级动物的饲养或实验观 察。层流架根据实验的需要也有正、负压之分。 层流架结构简单，投资少无需辅助设备，可独 立运转，适合于小型和短期的使用，该设备只 能控制空气洁净和通风指标，而其他环境指标 如温、湿度等，要由设施内加以控制，所以使 用有较大的局限性。
• 无菌动物（Germ free animals） • 是指机体内外均无任何寄生物（微生 物和寄生虫）的动物。此种动物在自 然界中并不存在，必须用人为的方法 培育出来。
• 隔离罩是保持罩内无菌环境的全密封 装置，是无菌动物饲养、实验操作和 实验观察的唯一设备。它主要是作无 菌控制，其他环境指标由罩外设备控 制，好的设备可维持1--3年的罩内无菌 状态。用于无菌动物的隔离罩是正压 装置，如作烈性感染实验应采用负压 隔离罩。
• 目前,通过微生物学的监察手段,按对 微生物控制的净化程度,把实验动物区 分为无菌动物（悉生动物）、无特殊 病原体动物、清洁动物、普通级动物 四类。
• 普通动物（Conventional animals,CV） • 是未经积极的微生物学控制，普遍地 饲养在开放卫生环境里的动物。垫料 和食物不经高压消毒，饮水为自来水， 不喂青饲料。鼠应排除肺炎病毒，沙 门氏菌和链球菌，地鼠不应有蛲虫。 普遍动物只能供教养和一般性实验， 不适用于研究实验。
• 悉生动物（Cnotobiotes animals） • 是指机体内带着已知微生物（动物或植 物）的动物。此种动物原是无菌动物， 系人为的将指定微生物丛投给其体内， 例如使大肠杆菌定居在无菌小鼠体内， 在进行微生物检查时，仅能检出大肠杆 菌。亦有人工投给二种以上的已知微生 物。
微生物实验用菌种管理规程(含表格)
微生物实验用菌种管理规程（ISO13485-2016/YYT0287-2017）1.0目的规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2.0适用范围适用于微生物实验用菌种管理，包括菌种的申购、传代、使用及销毁等。
3.0引用/参考文件ChP2015实用药品微生物检验检测技术指南4.0职责质量控制实验室负责菌种的申购、传代、使用、销毁等工作，QA负责监控和参与OOS调查。
5.0程序5.1术语和定义5.1.1标准菌株由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌。
5.1.2传代菌株用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种，3代后的传代菌株在需要时可以作为工作菌株使用。
5.1.3工作菌株用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
5.1.4菌种的代将菌种接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
5.2菌种来源5.2.1标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（CMCC）或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌种。
5.2.2质量控制实验室涉及到的菌种种类、代码、保存方法及保存条件如下。
菌种名称菌种代码保存方法保存温度保存期限TSA斜面2～8℃1个月金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501冷冻干燥管-20℃1年SDA斜面2～8℃3个月白色念珠菌CMCC(F)98001冷冻干燥管-20℃1年SDA斜面2～8℃3个月黑曲霉菌CMCC(F)98003冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月生孢梭菌CMCC(B)64941冷冻干燥管-20℃1年5.3菌种的申购、验收、保存5.3.1菌种的申购5.3.1.1微生物室QC依据菌种的库存及菌种的使用情况，提出采购申请，申请需明确菌种的名称，标准编号以及申购数量等信息。
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律ห้องสมุดไป่ตู้ 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
实验动物微生物学分类及控制
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
第三章微生物控制课件
原因，而不是乳酸杆菌。 • 近年发现，细菌感染和其他牙病也相关。
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7、在毒理和药理学方面的研究
• 普通豚鼠与无菌豚鼠对青霉素的反应 • 普通豚鼠与无菌豚鼠对大豆的反应
• 无菌豚鼠（经口）福氏痢疾杆菌——死亡 先接种大肠杆菌——不死亡
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在病毒学研究中的应用
• 病毒性疾病的研究：无菌动物是研究病毒的毒性、病毒的 提纯、安全疫苗和特异性抗病毒血清的有用工具。
• 某些病毒的致病作用与机体本身内在关系的研究:如正常猫 易感猫瘟病毒，而无菌猫不易感，说明感染受肠道微生物 的影响。
消化系统：（消化道菌群的有无） • 盲肠大。其盲肠约占体重的25% ，（尤其是家兔、豚鼠等草食动
物。）盲肠壁肌层变薄，体积变大，盲肠及内容物的总重量为普 通动物的 5-10 倍。 • 肠蠕动减慢，肠绒毛细疏、固有层网状内皮细胞减少，肠壁组织 胺含量低。
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形态结构
血液循环系统： • 心脏相对变小， • 白细胞数量减少，且数量波动范围小。
2、无菌动物的研究 （1910-1940年）
维生素Ｂ（无菌蝇蛆）、饲养环境
3、无菌动物的培育
大鼠、小鼠、豚鼠、家兔
无菌动物的培育和使用是实验动物科学的第二次重大进展。
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三、基本特征
外观状态 形态结构 生理功能 生化代谢
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外观状态
与普通动物无差别
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形态结构
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４、在老年病学研究中的应用
选修一2.1微生物实验室培养(上新课用)
⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当
⑶适宜的pH值：加入缓冲剂 细菌偏碱，真菌偏酸。
细菌培养基pH中性或偏碱性pH为：6.5-7.5，霉菌培 养基呈酸性pH为：5.0-6.0。放线菌pH为：7.5-8.5。
二 、无菌技术：
• （看教材15页回答）
• 1.获得纯净培养物的关键是什么？ • 2.无菌技术包括哪四大方面？ • 3.消毒与灭菌有什么区别？
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养 微生物吗？为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养 基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
四、大肠杆菌的纯化培养
分散成单个细胞,形成单个菌落
1.定义： 单个 固体培养基上 或少数菌体 大量繁殖
子细胞群体
酒紫8精0外℃、线、氯1气5m、in石炭酸等
物高压品蒸，汽16灭0～菌170℃ 1培～养2小基时，
100KPa、
121℃、15～30min
3.常用的消毒与灭菌的方法
(1)消毒的方法：
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min 或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁 尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……
二、无菌技术 防止外来杂菌的污染
2.消毒与灭菌：
消毒
灭菌
较为温和理化方法， 强烈的理化方法， 定义 杀死部分有害菌体 杀死所有微生物
（不包括芽孢、孢子） （包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
灼烧灭菌
方法 巴10氏0℃消、毒5法~6min 化70学~7药5℃剂、30min