【酶工程】酶分子侧链基团的化学修饰
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的基本性质
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点【摘要】酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。
但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。
对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。
简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。
1 酶的化学修饰的基本原理酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。
前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性．催化特性以及热稳定性,Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Lcu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。
1. 1功能基团的修饰酶分子可离解的基团如氨基(NH2)、羧基(～COOH)、羟基（OH)、巯基(sH)、咪锉基等都可用来修饰。
脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。
这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。
1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。
表面活性剂的亲水部分与酶连在一起，而亲油部分伸向有机溶剂，从而提高了酶在有机溶剂中的溶解度和分散度。
第四章酶工程 酶的化学修饰_提纲_2016
4.3.1 几种重要的修饰反应 （1） 酰基化反应
（2）烷基化反应
（3）氧化和还原反应
（4）芳香环取代反应 4.3.2 酶分子侧链基团的化学修饰举例 1、巯基的化学修饰
4
2、咪唑基的化学修饰
5
3、酚羟基的化学修饰
4、胍基的化学修饰
6
5、色氨酸吲哚基的化学修饰 6、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰
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聚乙二醇： 聚乙二醇是一个线性分子，有良好的生物相容性，在体内不残留，无 毒，无抗原性，是一种优良修饰剂。 活化方法：三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法 三氯均嗪法是一个常用的方法。 三氯均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代
右旋糖酐： 右旋糖酐是由 α-葡萄糖经 α-1, 6 糖苷键形成的多糖，有较好的水溶性及 生物相容性，可用作代血浆。 右旋糖酐链上的相邻双羟基结构经活化后可与酶上的自由氨基相结合。 溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下 活化，然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反应，共价结合。 技术要点：
1
造。
化学修饰过程中需考虑的因素 ¾ 对酶性质的了解：活性部位，稳定条件，侧链基团性质，酶反应最适条 件等； ¾ 对修饰剂的要求：分子量，水溶性，活性基团，活化方式，活化条件， 修饰后酶活性的半衰期； ¾ 对反应条件的选择：分子比例，反应条件（反应温度、pH、时间、溶剂 性质、离子强度等）
4.2.2 化学修饰的方法学 1、 修饰反应专一性的控制 （1）试剂的选择：修饰目的；反应生成物容易定量测定；试剂大小
研究酶分子的解离-缔合现象 推算出酶分子大小、形态及构象变化 测定氨基酸残基在酶分子中存在的状态
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利用双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团的距离 2、确定氨基酸残基的功能 e.g. 在丙酮酸激酶的精氨酸残基的修饰反应过程中，伴随着精氨酸残基的修 饰，酶分子可逆地失活，底物保护作用说明酶分子在底物磷酸烯醇式丙酮酸的 磷酸结合位点具有一个必需的精氨酸残基 3、测定酶分子中某种氨基酸的数量
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
酶分子的化学修饰
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
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根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶的化学修饰PPT课件
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（一）酶的表面修饰
1.1 化学固定化： 通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残
基将酶共价连接到惰性载体上。
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1.2 酶的小分子化学修饰作用
小分子化合物对酶活性部位或以外的侧链基团 进行化学修饰，常用修饰剂有氨基葡萄糖、 醋酸酐等。
通过两个途径实现 化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的 种类少。 蛋白质工程：利用基因操纵技术。
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2.3 肽链伸展后的修饰
❖ 脲、盐酸胍处理使酶肽链充分伸展，修饰酶， 然后复性（具有某种催化活性的构象）。 Saraswothi等，先让酶变性，然后加入 相应于所希望酶活力的竞争性抑制剂，待获 得所希望酶的构象时，用戊二醛交联，以固 定这个构象，然后透析除掉这种抑制剂。以 丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一 种“酸性酯酶”。
二、 酶修饰的方向
❖ 1． 核酸水平（生物酶工程的内容）
通过基因工程方法改变编码酶分子的基 因而达到改造酶的目的。
❖ 2． 蛋白质水平（化学修饰、定点突变 等）
通过分子修饰的方法来改变已分离出来 的天然酶的活性。
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酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
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④ 催化基团（部位）是在催化反应中直 接参与电子接受关系的部位。
牛 胰 凝 乳 蛋 白 酶 Ser195 ， His57 ， ASP120
枯草杆菌蛋白酶，Ser221, His64, ASP32
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⑤ 底物结合部位：酶活性部位直接与其 底物结合的残基构成的空间部位。
酶分子侧链基团修饰1
侧链基团修饰 side residues modification
采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发 生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的 结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需 基团时经常采用。
氨基
巯基 吲哚基 酚基
羧基
胍基
ห้องสมุดไป่ตู้
咪唑基
谢谢
常见基团的化学修饰反应：氨基
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常见基团的化学修饰反应：羧基
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常见基团的化学修饰反应：巯基
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常见基团的化学修饰反应：胍基
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常见基团的化学修饰反应：酚羟基
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常见基团的化学修饰反应：咪唑基
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常见基团的化学修饰反应：吲哚基
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作用
增加稳定性
提高酶活性 降低抗原性 引起酶催化活性、功能的改变 获得自然界原来不存在的新酶种
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残 基上的功能团，包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚 基、咪唑基、吲哚基等。
维持酶活 性中心应 有空间构 象所必须 基团
与底物相结 影响底物中某些化 合，使底物 学键的稳定，催化 与酶的一定 底物发生化学反应 构象形成复 并将其转化成产物。 合物
酶工程学第九周分子修饰
烷基化试剂
可被修饰的氨基 酸残基侧链
R ——X： 2，4——二硝基氟苯，DNFB
多肽序列分析法：Sanger N-端序列分析法，1945年
Na2S4O6：连四硫酸钠
四硝基甲烷
二硫二硝基苯甲酸
4，4’－二硫二吡啶 对氯汞苯甲酸 2－氯汞－4－硝基苯酚 N-乙基马来酰亚胺 过氧化氢氧化
氨基的化学修饰
3.通过修饰降低或消除酶的抗原性
当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清中就 可能出现与此外源蛋白特异性结合的物质，这些物质称为抗体， 能引起体内产生抗体的物质称为抗原。
大分子化学修饰是降低甚至消除酶抗原性的有效方法之一
猪肝尿酸酶用白蛋白修饰: 最适pH由天然酶的10.5,下降到7.4—8.5
举例：超氧化物岐化酶（SOD）
O2- + O2- + 2H+ =H2O 2 +O2 SOD作用：保护DNA，蛋白质和细胞膜
SOD药用：类风湿性关节炎，白内障，膀胱炎，皮肤炎，红斑 狼疮等。
SOD静脉注射：t1/2=6~30min 右旋糖酐-SOD：t1/2=7h 聚乙二醇-SOD：t1/2=35h
三、修饰方法
修饰酶
四、大分子化学修饰的优点
1.通过修饰提高酶的活性
核糖核酸酶 Vs 右旋糖酐修饰核糖核酸酶
1
： 2.25
胰凝乳蛋白酶 Vs 右旋糖酐修饰胰凝乳蛋白酶
1
： 5.1
2.通过修饰增强酶的稳定性
酶的半衰期t1/2：酶的活力降低到原来活力一半时所经过 的时间。
很多修饰剂分子具有多个活性基团，常与酶形成多点交 联，使酶的空间结构稳定，特别是使酶活性中心的构象得到保 护。
乙酸酐 2’4’6－三硝基苯酚 2’4－二硝基氟苯 碘代乙酸 还原烷基化
酶工程考试题目
酶工程考试复习资料一、名词解释（3×5=15分）（注意：回答一为课本上的原话，回答二为老师PPT上的内容，回答三为百度搜索结果，大家根据自己的情况选择适合自己的答案，避免雷同）1.化学酶工程:化学酶工程也可称为初级酶工程，酶工程主要采用两种方法。
一是化学酶工程，即通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶；另一种是生物酶工程，即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而声查性能稳定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。
因此酶工程可以说是把酶学基本原理与化学工程技术及重组技术有机结合而形成的新型应用技术。
2.酶的光学异构专一性回答一：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的一个。
回答二：只作用于具有不对称碳原子造成的镜像异构体（光学异构体）中的1种。
3.酶的活性中心回答一：在构成酶分子的氨基酸残基中只有少数的氨基酸残基与酶的催化活性相关，通常将这些氨基酸集中的、与酶的活性相关的区域称为酶的活性中心。
回答二：酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生化学反应的部位，称为酶的活性中心回答三：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域4.酶催化的邻近效应回答一：所谓邻近效应，就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。
回答二：底物与底物之间、酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，从而使反应速率大大增加。
回答三：邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应5.盐析法回答一：利用无机盐破坏蛋白质分子的水化层，中和表面的电荷，使之聚集形成更大的分子团而沉淀。
回答二：根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。
回答三：盐析法是指在目标溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。
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4．咪唑基的化学修饰
常用修饰剂：碘乙酸、 焦碳酸二乙酯等； 其中焦碳酸二乙酯在近 中性的条件下对组氨酸 残基上的咪唑基具有较 好的特异修饰能力，而 且产物在240 nm波长处 有最大吸收峰，可以通 过修饰得知分子中咪唑 基的数量。
5. 胍基的化学修饰 来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨 基酰基化。 修饰剂：
丁二酮
几种重要的修饰反应
1．烷基化反应
2．酰化及其相关反应
3．氧化和还原反应
4．芳香环取代反应
• 重要的修饰反应*
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应
• 特定氨基酸残基侧链基团的 化学修饰*
巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫基的化学修饰
酶分子侧链基团的化学修饰
• 一．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 • 二．几种重要的修饰反应
一．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
•酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 等。
1．巯基的化学修饰
• 巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰 剂与酶蛋白 侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空 间构象、特性和功能。
①乙酸酐修饰 ②2,4,6—三硝基苯磺酸修饰. ③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger 反应) ④氨基的烷基化.这类试剂包括 卤代乙酸,芳香卤和芳香磺酸等. ⑤丹磺酰氯(DNS)修饰. ⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即 Edman反应)
3．羧基的化学修饰
修饰羧基的反应专一性较差。 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶 分子中羧基的数目。
• ①烷基化试剂 烷基试剂中用得最多的是碘乙酸，碘乙 酰胺,巯基乙醇，谷胱甘肽(GSH)。
• E—SH + ICH2COOH(或ICH2CONH2)→E—S— CH2COOH(或E—S—CH2CONH2)+HI ②汞试剂 这类试剂如HgCl2，对氯汞苯甲酸(pCMB)和 2—氯汞硝基苯酚等。
2．氨基的化学修饰