单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)
单核细胞增生李斯特氏菌检验技术
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
单核增生李斯特菌形态特征
单核增生李斯特菌形态特征单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性、无芽孢、无鞭毛、不能运动、可产生荚膜的细菌。
它是一种人畜共患病原体，可导致食物中毒、脑膜炎、败血症等疾病。
本文将详细介绍单核增生李斯特菌的形态特征。
一、细菌的大小和形状单核增生李斯特菌的个体大小不一，一般为（1-2）μm×（0.5-1.5）μm，有时可达2μm×1μm。
其形状为短杆状或略呈球形，有时可见到丝状或连成链状。
二、细菌的细胞结构单核增生李斯特菌的细胞结构与其他革兰氏阳性菌相似，由细胞壁、细胞膜、细胞质和核质构成。
其细胞壁厚约20-30nm，表面有脂多糖（LPS）层，可引起强烈的炎症反应。
细胞膜由脂蛋白和脂质双层组成，可将细胞与外界环境隔开，维持细菌内部的稳定环境。
细胞质内有核糖体、核蛋白体和核酸等重要成分。
核质是细菌遗传物质，由双螺旋DNA和蛋白质组成。
三、细菌的繁殖方式单核增生李斯特菌的繁殖方式是二分裂，分裂时将遗传物质平均分配给两个子代细胞，完成一次分裂需要约20分钟。
在适宜的生长条件下，单核增生李斯特菌可形成芽孢，但该芽孢无繁殖能力，仅作为休眠形式存在。
四、细菌的荚膜单核增生李斯特菌在生长过程中可产生一层荚膜，主要由多糖组成。
荚膜对细菌具有保护作用，可增强其抗逆性，有利于细菌在自然环境中的存活。
根据荚膜的不同，单核增生李斯特菌可分为13个血清型，其中最常见的是血清型1/2a和血清型4b。
五、细菌的运动能力单核增生李斯特菌不能运动，也没有鞭毛，因此不能自主移动。
这与其他革兰氏阳性菌如肺炎链球菌等有所不同。
六、细菌的抵抗力单核增生李斯特菌对热和干燥具有较强的抵抗力，在25-30℃之间能生长良好，4℃下可存活数周，在冰冻食品中能存活数月。
它对酸性环境有一定耐受能力，能在pH 4.2-9.3范围内生长。
此外，单核增生李斯特菌对多种抗生素和消毒剂具有抗性，如对青霉素G、氨苄西林、红霉素、四环素等具有抗性。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析
现代食品XIANDAISHIPIN 219/分析检测Analysis and Testing doi:10.16736/41-1434/ts.2021.06.062食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析Validation Results and Analysis of Listeria monocytogenes in food◎ 杨丰旭，曹欢欢，李 爽，孟凡信（朝阳市检验检测认证中心，辽宁 朝阳 122000）YANG Fengxu, CAO Huanhuan, LI Shuang, MENG Fanxin (Chaoyang Inspection, Testing and Certification Center, Chaoyang 122000, China)摘 要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，增强实验室竞争力，本实验室参加了大连海关技术中心组织的能力验证，结果表明编号为075和102的样品均检出单核细胞增生李斯特氏菌。
本次能力验证结果评价为满意。
关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Abstract：In order to improve the detection ability of Listeria monocytogenes in food and enhance the competitiveness of the laboratory, our laboratory participated in the proficiency test organized by the Dalian Customs Technology Center. The results showed that Listeria monocytogenes were detected both in samples numbered 075 and 102.The results of theproficiency test were evaluated as satisfactory.Keywords：food; Listeria monocytogenes ; proficiency testing中图分类号：R155.5单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ）在自然界分布广泛，是一种细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，可通过污染食品而引起人、畜单核细胞增多，从而导致脑膜炎、败血症、流产等疾病[1]。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析作者：彭怡许红玉黄厚强张曲来源：《中国食品》2024年第02期单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），简称为单增李斯特氏菌，是一种需氧兼性厌氧的食源性病原菌、革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界中。
其中，奶制品、肉制品、水产品、海产品、禽类食品、蔬菜等容易受到该菌污染，误食用含有该菌的新生儿、老年人等免疫力低者易患脑膜炎、败血症，孕妇则易发生早产或流产，致死率高达20%-30%，给食品安全造成严重威胁。
近年来，国内外关于单增李斯特氏菌的主要检测方法包括国标法、免疫学检测法、生物传感器检测法等，这些方法各有优缺点。
能力验证通过对实验室间的检验能力进行比对，评价参加者的能力，是证明实验室检验能力的重要方式之一。
资阳市食品药品检验检测中心生物检验科参加了由四川省食品检验研究院组织的“食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证”，采用国标法《GB 4789.30-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》第一法对样品进行定性检验。
一、材料与方法1.样品。
由四川省食品检验研究院提供3份单核细胞增生李斯特氏菌样品，每份样品包括一瓶白色球状西林瓶装和一袋质量约为25g的奶粉，样品编号分别为LM-029、LM-177和LM-307。
2.菌种。
单增李斯特氏菌ATCC 19115、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、英诺克李斯特氏菌ATCC 33090，均由广东环凯生物科技有限公司提供。
3.主要试剂。
脑心浸出液肉汤（BHI）、李氏菌增菌肉汤（LB1，LB2）基础、PALCAM 琼脂、李斯特氏菌显色培养基、SIM生化管、HBI单增李斯特氏菌生化鉴定条（GB），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、血平板、革兰氏染色液试剂盒、3%过氧化氢、单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒，购自北京陆桥技术股份有限公司。
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。
它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。
乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。
为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。
需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。
为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。
同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。
单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※菌落特征 ※液体培养基培养18 h～24 h后，呈轻度浑浊，数天后产生黏稠的沉淀， 振荡时呈螺旋状上升，继续培养可形成颗粒状沉淀，不形成菌环、菌膜。 ※半固体培养基中37 ℃、24 h穿刺培养，沿穿刺线呈云雾状，随后缓慢扩 散，在培养基表面下3 mm～5 mm处呈伞状。
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一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※生化特征 ※单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 ℃、24 h培养,可以 分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉 子糖、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP 试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。
取LB2 二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM 琼脂平板， 于36 ℃±1 ℃培养24 h~48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在 PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落 有黑色凹陷；在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，参照产品说明进行判定。
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一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※菌落特征 ※普通营养琼脂平板上为微带珠光露水样菌落，细小，半透明、边缘整齐； 45度斜射光下，菌落呈特征性蓝绿光泽。 ※血平板上培养的菌落呈灰白色、圆润，ß型溶血，溶血环直径达3 mm， 4 ℃ 放置4 d 后, 菌落和溶血环直径均增至5 mm，呈典型的奶油滴状。
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一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※培养特征 ※需氧或兼性厌氧，生长温度范围1 ℃～45 ℃，最适生长温度30 ℃～37 ℃，4 ℃或以下温度能缓慢增殖。 ※对营养要求不高，在一般培养基上均能良好的生长，在血清或全血琼脂 培养基上生长良好，加入0.2％～1％葡萄糖和2％～3％甘油更利于其生 长。
单核细胞增生李斯特菌基因组
单核细胞增生李斯特菌基因组
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的基因组包含多个染色体和质粒，其中主染色体长度约为3.2百万碱基对（Mb），编码约2600个可预测的蛋白质。
该菌的基因组具有以下特点：
1.基因组中富含长度的基因，其中许多与代谢、细胞周期和细胞壁结构有关。
2.它具有调节渗透压、调节转录和翻译、DNA复制和修复、代谢、细胞周期和细胞壁结构等功能的基因。
3.单核细胞增生李斯特氏菌的基因组具有潜在的代谢多样性，可以利用各种碳源和氮源进行生长。
4.基因组中包含多个与氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、核苷酸和脂类的代谢有关的功能基因。
5.该菌还具有潜在的运动能力，其基因组包含编码鞭毛蛋白和鞭毛马达蛋白的基因。
6.单核细胞增生李斯特氏菌的基因组对理化因素具有较强的抵抗力，这与其存在环境中的生存和传播有关。
总的来说，单核细胞增生李斯特氏菌的基因组复杂且高度可变，其中包含许多与生存、适应和传播有关的基因。
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单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）
荧光定量PCR检测试剂盒说明书
规格：48份/盒
用途：单核细胞增生李斯特氏菌PCR体外检测。
检测原理：
试剂盒中含有单增李斯特氏菌特异的引物，当样品中含有单增李斯特氏菌时，前增菌后提取的单增李斯特氏菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中单增李斯特氏菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交,同时被Taq酶水解,把探针上的荧光基团和淬灭基团分开,从而通过荧光增量来实时判断单增李斯特氏菌的存在。
产品盒组成：
试剂盒的保存条件及有效期：
1．本试剂盒于-20℃保存。
2．有效期为6个月。
适用仪器：
ABI7500，9600系列，MJopticon2，Bio-Rad等荧光定量PCR仪均可。
实验方法：
1．取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；采纳经典酚氯仿提取法，将提取到的模板进行检测或保存于-20℃以待检测。
2．将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶,按2U/管加入Taq酶，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.5ul+0.4ulTaq 酶。
3．加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min。
阴、阳性对比使用前置室温解冻。
在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对比各2ul，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。
4．上机扩增、检测区：反应条件为95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，60℃：40sec〔信号采集〕，40个循环。
反应体系设为25ul。
关于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。
结果分析：
关于MJOpticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入1-15之间的荧光值，进行Ct值的设置或拖动基线到合适的位置以确定ct值。
关于ABI7500，9600系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线的确定：取3-10或3-15个循环的荧光值，阈值设定原那么为阈值线刚好超过正常阴性对比品扩增曲线的最高点，而不显示Ct值为宜。
质控标准：
本试剂盒灵敏度为100拷贝/ml。
定量检测线性范围为：10-1010拷贝/ml。
阴性对比无Ct值显示或Ct值为40，阳性对比的Ct值≤30.0，否那么为实验失败。
结果判断：
1．检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。
2．检测样本Ct值>35.0且Ct值<40时，需重复检测一次，假如Ct值仍<40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否那么报告阴性。
3．样本不显示Ct值时，报告阴性。
试剂盒使用本卷须知
1．本试剂盒仅用于体外检测和研究用途，开始使用前请认真阅读本说明书全文。
2．实验必须严格分区操作：PCR前预备区——预备实验试剂；样本处理区——待测样本、模板处理；检测区——PCR扩增、检测。
3．有关实验室治理规范请参照国家相关部门颁布的基因扩增实验室的治理规范执行。
4．。