实验3 PEG介导的动物细胞融合技术
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较
PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较PEG（聚乙二醇）介导的鸡血细胞融合实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究细胞融合、基因转移、病毒感染等现象。
在这个实验中，PEG起到促进融合的作用。
本文将对常用的PEG诱导鸡血细胞融合实验方法进行比较。
1.直接混合法：直接混合法是最简单直接的方法，将两种不同细胞类型的细胞直接混合，加入PEG处理后，通过细胞的融合产生融合细胞。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至对数生长期。
b.将细胞收集、洗涤后，按照一定比例混合在一起。
c.在混合细胞悬液中加入PEG，进行处理。
d.处理后的细胞悬液进行培养。
优点：简单快捷，操作方便。
缺点：融合效率低，融合细胞的纯度较低，难以鉴定融合细胞。
2.等渗处理法：等渗处理法使用PEG使两个细胞类型的渗透压基本相等，减小由于渗透压差带来的融合细胞死亡的可能性。
实验步骤类似于直接混合法，不同之处在于在混合前要将细胞分别处理加入等量的PEG。
优点：可以减少融合细胞死亡的可能性。
缺点：融合效率仍然较低，难以确保融合细胞的纯度。
3.高瓶底法：高瓶底法是一种间接融合法，将两种细胞性的细胞分别培养到八倍增生指数时接种于两个高菌瓶内，将角质层去除，用高菌瓶口与高速离心的纺棉花轻摩转盘瓶底，离心至指定g数。
因离心后双方菌瓶接触，菌体外膜断裂，细胞在瓶壁内微小空间聚集，有利于融合。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至八倍增生指数。
b.将细胞收集后接种于两个高菌瓶内。
c.去除角质层，将高菌瓶口与高速离心的纺毛轻摩转盘瓶底。
d.将菌瓶离心至指定g数。
优点：融合效率较高，融合细胞纯度较高。
缺点：操作复杂，需要使用专用设备。
4.电熔法：电熔法是利用电场将两种细胞融合的方法。
通过电熔法可以达到融合效率较高的效果。
实验步骤：a.将两种不同类型的鸡血细胞分别培养至对数生长期。
b.将细胞收集后接种于电熔腔中。
c.设置一定的电场参数，通过电场产生的作用使细胞融合。
PEG诱导的细胞融合实验
【实验操作】
4、 PEG介导融合：用手指轻弹离心管底部，使沉 淀松散，然后将离心管放在37ºC水浴中； 吸取预 热至37℃的50％PEG 0.5ml ，逐滴加入到细胞沉 淀中，边加边振摇浑匀，使细胞在50％PEG 中总 时间控制在90秒之内；
PEG诱导的细胞融合实验
细胞融合（cell fusion）
• 又称细胞杂交（cell hybridization），是指 两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的 现象。
用细胞融合方法培育的薯番茄
细胞融合抗盐碱耐干旱葡萄新品种
细胞融合生产 单克隆抗体
细胞融合的诱导
1、病毒诱导：如仙台病毒（Sendaivirus） ，主要用于动
• 了解聚乙二醇诱导细胞融合的原理与技术； • 学会鉴别： 1、鸡红细胞 2、小鼠腹水瘤细胞 二、实验器材 普通离心机 水浴锅：50ºC，37ºC 计数板
三、实验试剂
1、180IU/ml肝素钠生理盐水溶液 2、Hanks溶液 3、50％PEG：将10gPEG加入带盖离心管中，
融合细胞核数 ×100％ 融合细胞核数＋未融合的细胞核数
【注意事项】
• 保持PEG温度，否则易凝固 • PEG处理时间不宜过长，否则会造成细胞
破坏或有多个细胞彼此融合形成巨大的合 胞体。 • 经PEG处理后加液混匀时应轻轻吹打，以 免刚刚融合的细胞分开。
【参考书】
1、《体外培养的原理与技术》第一版，薛庆 善编，科学出版社。
动物细胞融合实验实验报告
动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。
PEG介导的细胞融合
PEG介导的细胞融合摘要：细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的现象，也称细胞杂交，可通过自发或人工诱导实现。
本实验中主要是以小鼠的脾脏淋巴细胞为融合实验材料，通过化学方法（聚乙二醇PEG）来最终使细胞达融合，主要目的是为了探究不同浓度的PEG与细胞融合率的关系。
将小鼠脾脏取出制成脾脏淋巴细胞悬液后，分别取1毫升分装到A、B、C、D、E五根离心管中，离心后加入不同浓度的融合剂各0.5毫升，实验中设置了20%、35%、50%、65%、80%五个PEG浓度梯度，经处理之后制成玻片在高倍显微镜下观察，对视野中细胞总数和融合细胞对数进行计数，就算融合率，最终得出结果。
结果表明：在一定浓度范围内（20%-70%），细胞的融合率与PEG的浓度成正比关系；当浓度过大时，细胞融合率反而会有降低。
关键词：细胞融合；PEG；融合率；不同浓度前言：人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。
细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。
细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。
因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。
这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
1.材料与方法1.1实验材料：小鼠脾脏细胞1.2实验器材：10ml离心管、吸管、载玻片、盖玻片、离心机、恒温水浴锅、显微镜、解剖剪刀、镊子、培养皿、漏斗、尼龙布、1ml注射器、6#针头。
1.3试剂：PEG、D-Hanks液、蒸馏水、0.87%NH4Cl。
peg诱导细胞融合原理
peg诱导细胞融合原理
PEG诱导细胞融合原理
PEG是聚乙二醇的缩写，是一种具有高分子量的线性聚合物。
PEG在
生物学研究中被广泛应用，其中最常见的应用之一就是诱导细胞融合。
细胞融合是指将两个或多个细胞融合成一个单独的细胞。
这种技术被
广泛应用于生物学研究中，例如制备杂交瘤细胞、制备单克隆抗体和
产生转基因动物等。
PEG诱导细胞融合的原理是利用PEG分子与细胞膜相互作用，使得两个或多个不同类型的细胞在PEG存在下发生融合。
具体来说，PEG通过以下机制促进了细胞融合：
1. 破坏细胞膜结构
PEG分子可以与水形成氢键，并且可以与亲水性区域结合。
当PEG溶液与细胞接触时，它会插入到细胞表面，并破坏部分磷脂双层结构，
从而使得两个或多个不同类型的细胞暴露出其内部的细胞质。
2. 促进细胞膜的接触
PEG分子可以通过两种方式促进细胞膜的接触。
首先，PEG可以降低水的表面张力，使得两个或多个细胞之间的距离缩小。
其次，PEG可以与细胞膜表面的亲水性区域结合，从而增加了两个或多个细胞之间的吸引力。
3. 促进细胞融合
当两个或多个不同类型的细胞表面接触时，PEG会形成一个临时性的孔道，使得两个或多个细胞质混合在一起。
这些孔道很快就会关闭，并且新形成的单一细胞会拥有所有原始细胞中所包含的遗传物质和生物学特性。
总之，PEG诱导细胞融合是一种简单、有效、广泛应用于生物学研究中的技术。
它利用PEG分子与细胞膜相互作用来促进不同类型细胞之间发生融合，并且可以产生许多重要的研究工具和应用。
聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合实验原理及步骤
实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合【课前预习】1．介导细胞融合的方法有哪些？2．细胞融合技术有哪些方面的应用？【目的要求】掌握细胞融合原理以及应用PEG 诱导细胞融合的方法。
【基本原理】两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。
因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。
这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus) ，聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH2OCH2)n CH2OH，相对分子质量在200-6000 均可用作细胞融合剂。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
PEG诱导细胞融合
科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合日期姓名*** 系年级2011级生物基地学号***实验一利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合摘要细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。
某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
关键词细胞融合；人工诱导；PEG前言人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。
细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。
因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。
这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
一．实验目的1.了解动物细胞融合的常用方法及原理。
2.掌握利用PEG为介导物对细胞进行诱导融合的方法。
细胞生物学实验报告——动物细胞融合
山东大学细胞生物学实验报告聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验2012/9/11实验目的：了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。
实验原理：1. 细胞融合的概念两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。
细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。
2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物理诱导。
1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台病毒（HVJ ）[1]。
1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒（HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。
1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇（Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛的细胞融合方法。
化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。
比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。
80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5]，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。
电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。
当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。
这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。
图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。
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中国海洋大学实验报告
姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学
科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006
PEG 介导的动物细胞融合技术
一、实验目的
（１）、通过实验，对体细胞融合有一个清醒的认识
（２）、通过ＰＥＧ介导鸡血细胞融合，初步掌握利用ＰＥＧ介导动物细胞融合的实验技术。
二、实验原理
真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核的细胞的过程称为细胞融合，通过此技术可以实现不同种类的细胞的融合。
基因型相同的细胞融合称为同核体（ｈｏｍｏｋａｒｙｏｎ），基因型不同的细胞融合称为异核体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ）
目前，诱导细胞融合的技术主要有三种：病毒，聚乙二醇（ＰＥＧ），电激。
第一种方法是通过生物病毒的方式，诱导细胞与细胞之间的融合。
后两种方法通过化学物理的手段使得细胞膜的膜脂类分子的排列发生变化，去掉作用因素后，质膜分子的排列恢复原有的形态，
在恢复的过程中，可以诱导相接触的细胞发生融合。
ＰＥＧ介导的细胞融合，其融合效果受到以下几个因素的影响
①、ＰＥＧ的分子量与浓度
ＰＥＧ的分子量及其浓度越大，细胞融合效果越明显，但对细胞的毒性也越大。
本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ，浓度为５０％
②、ＰＥＧ的ｐｈ值
经验证，ＰＥＧ的浓度在８.０～８.２时，融合效果最好
③、ＰＥＧ处理时间
处理实验越长，融合效果越好，但对细胞的毒性也越大。
故一般将处理时间限制在１分钟以内。
本实验不涉及后续的细胞培养，所以处理时间可适当放宽至数分钟
④、融合时的温度
温度越高，细胞膜脂质的流动性越好，故在细胞可以承受的范围内，适当的提高温度有利于细胞的融合
三、实验材料
新鲜鸡血
０.８５％生理盐水
ＧＫＮ液
５０％ＰＥＧ液
四、实验步骤
取出鸡血悬液1ml ，加入0.85%生理盐水，
4ml ，混匀。
1200r/min 离心5分钟，移除上清液
加入4ml 0.85%生理盐水，重悬细胞，1200r/min
，离心5min ，
移除上清
加入4ml 0.85%生理盐水，重悬细胞，1200r/min ，离心10min ，
移除上清
向离心沉淀中加入2mlGKN ，使之成为10%的细胞悬液
五、实验结果
本实验分为四个实验组，经
PEG 处理的时间分别为：1,2,3,4分
取血球悬液1ml ，加入0.5ml 50%的PEG 液，混匀，开始计时
从计时开始，到盖上盖玻片在显微镜下观察为止。
将处理1、2、3、4分钟的细胞样品，显微镜下观察计数视野内融合细胞的核数和视野内细胞的总核数，从而计算融合率
钟，各个实验组中视野内融合的细胞的核数，视野内细胞核的总数，融合率如下：
处理时间
项目视野内融合的细胞的
核数
视野内细胞核的总
数
融合率
（%）
1min 93 137 67.9 2min 134 186 72.0 3min 198 256 77.3 4min 258 320 80.6
处理2min效果
六、思考题：
１、细胞融合方法主要有哪几种，各有何优缺点？
答：
目前主要由三种方法，ＰＥＧ、病毒法、电激法。
①、ＰＥＧ介导的细胞融合
优点：细胞融合率较高，廉价，操作简便
缺点：ＰＥＧ对细胞有一定的毒性，不适用于对卵细胞的细胞融合，可重复性差。
②、病毒法,使用副念病毒科的病毒诱导细胞融合
优点：病毒体外易于培养
缺点：使用病毒诱导的细胞融合效果不稳定
③、电激法：
优点：可重复性强，对细胞无毒害
缺点：成本高
２、ＰＥＧ法诱导细胞融合的因素有哪些？
答：
①、ＰＥＧ的分子量与浓度
ＰＥＧ的分子量及其浓度越大，细胞融合效果越明显，但对细胞的毒性也越大。
本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ，浓度为５０％
②、ＰＥＧ处理时间
处理实验越长，融合效果越好，但对细胞的毒性也越大。
故一般
将处理时间限制在１分钟以内。
本实验不涉及后续的细胞培养，所以处理时间可适当放宽至数分钟
③、ＰＥＧ的ｐｈ值
经验证，ＰＥＧ的浓度在８.０～８.２时，融合效果最好
④、融合时的温度
温度越高，细胞膜脂质的流动性越好，故在细胞可以承受的范围内，适当的提高温度有利于细胞的融合
3、本实验中所用的PEG融合方法是否适用于植物细胞，为什么？
答：
不适用。
因为植物细胞存在细胞壁，使用ＰＥＧ融合方法使得细胞的细胞膜的脂类分子层结构发生暂时的改变，从而介导细胞的融合。
由于细胞壁的存在，组织了植物细胞的融合，ＰＥＧ融合方法所以不适用于植物细胞的融合。
４、本实验的本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？如果因实验需要必须选用小鼠血细胞作为实验材料，应如何对融合细胞进行鉴别？
答：因为兔子或小鼠等哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，在普通光学显微镜下，不利于计数，所以不适用它们的血细胞进行细胞融合的实验。
①、可以对细胞表面保守的蛋白进行ＥＬＩＳＡ或免疫荧光染色
等处理，分析信号的强度，进行分析。
②、可以通过化学基团标记细胞，进行分析。
③、可以测定细胞的呼吸强度等生理特性，代谢强的，为融合的细胞。
④、融合实验前对细胞进行荧光标记，后可以通过流式细胞术将融合程度不同的细胞分离开来。
七、总结与讨论
1、PEG液要现配现用，因为对人体有害，所以在配置和使用时应当特别注意。
2、实验中所用的Ａｌｓｅｖｅｒ液的作用是①、为细胞提供营养②、防止血液的凝固
3、实验所用的ＧＫＮ溶液是一种缓冲液而且也可以为细胞提供营养
4、因为在ＰＥＧ的存在下就可以使细胞膜的结构发生变化，PEG 处理的时间应该掌握到盖上盖玻片在显微镜下观察为止。
因为加上盖玻片可以相对限制细胞相对位置，使得细胞融合速度减慢。
但是不能保证细胞绝对不融合，所以观察到的样品经ＰＥＧ处理的时间一般都比预计的时间长。
5、本实验开始计数时，计数规则出错，计算融合率应用视野内融合细胞的核数÷视野内细胞的总核数；而不是视野内融合的细胞数÷视野内的细胞总数，原因是：
a 、前一种方法被除数是融合的细胞的核数可以代表融合的细胞的个数，后一种方法被除数是视野内融合的细胞数不能代表融合的细胞的个数。
b 、前一种方法除数是视野内细胞的总核数可以代表实验中所有的细胞，后一种方法除数是视野内细胞的总数包括融合的细胞数和未融合的细胞数，不能代表实验中所有的细胞数。
c 、前一种方法计数时数细胞核目标较为明显，后一种方法计数细胞不易
综上，%100⨯=视野内细胞核的总数
视野内融合细胞的核数
融合率，可以较快，较准地反映
出实验组中所有细胞在ＰＥＧ条件下，融合的情况。