紫外吸收法测蛋白质含量的方法
紫外吸收法测定蛋白质含量分析灵敏度的测定
紫外吸收法测定蛋白质含量分析灵敏度的测定一．实验目的：1.掌握紫外分光光度计法测定蛋白质浓度的原理与方法，及其优缺点；2.掌握分析灵敏度的概念及原理；3.进一步掌握标准曲线的测定及利用标准曲线求物质浓度的方法。
二．实验原理：分析灵敏度即可检测的最低分析物浓度。
这个浓度限值对毒品检验在法庭上特别重要，希望通过检测知道样品中究竟有无药物，这是很关键的。
另外，肿瘤标志物及许多特定蛋白应该有一个可检测的最低浓度或某个量；如：前列腺特异蛋白，这是病人治疗后监视复发的重要信息；长期来，临床对报告的前列腺特异蛋白究竟有意义的最小量要求予以明确。
核酸检测报告的阴、阳性也要求说明，能检出的最小拷贝的核酸量或者相当于多少病毒，因此，确定检测系统的可报告底限是重要的分析性能。
检测低限（LLD ）每次检测，总是做一个空白样品。
检测方法常以空白响应值校准至零点，再检测各检测样品的反应响应值。
这些样品的反应响应值在扣除了空白相应量后，是分析物的对应响应量。
但是，空白响应量也有波动。
若重复多次做空白检测，以空白均值和标准差表示这些空白响应量的平均水平和所有空白响应量对于空白均值的离散程度指标。
在确定方法性能或绘制标准曲线时，常常以空白均值表示空白响应量。
实际工作时，每次只做一个空白，这个空白响应量各有50%的可能性，大于或小于空白均值。
当空白响应量小于空白均值，对同一个样品检测响应值（为扣除空白响应量）。
似乎反映分析物要多一点，检测方法要灵敏些，当空白响应量大于空白均值，似乎原先可以检测出来的东西检测不出来了。
统计说明：如果空白响应量的波动服从正态分布规律：每个单位检测的空白响应值x 有95%的可能性为：空白空白空白空白s *2x x *2+≤≤-s x即空白空白空白s *2x -x ≤其中较空白均值小的一半会使分析物更易检测出来，若有一个检测响应量较空白响应量均值大于空白s *2，仍然认为是响应量的可能性只有5%；有95%的可能性属于样品中分析物形成的检测响应值；它较空白均值差空白s *2以上。
实验9 紫外吸收法测定蛋白质含量
实验9 紫外吸收法测定蛋白质含量（一）原理蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。
在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。
若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。
此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。
但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。
（二）试剂及器材（1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。
（三）操作1. 280nm的光吸收法（1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。
混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。
以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。
（2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2．280nm和260nm的吸收差法将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。
应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。
公式：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 OD280—0.74 OD260。
紫外吸收法实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外吸收法的基本原理和操作步骤。
2. 学习使用紫外-可见分光光度计进行蛋白质浓度的测定。
3. 通过实验验证紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。
二、实验原理紫外吸收法是一种基于物质分子对紫外光的吸收特性进行定量分析的方法。
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，这些氨基酸的苯环结构中含有共轭双键，使其在280nm波长处具有特征性吸收峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液的吸光度与其浓度呈线性关系。
因此，通过测定蛋白质溶液在280nm波长处的吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：紫外-可见分光光度计、移液器、试管、石英比色皿等。
2. 试剂：蛋白质标准品、不同浓度的蛋白质溶液、空白溶液（通常为溶剂）、缓冲液等。
四、实验步骤1. 标准曲线的制作：1.1 取7支试管，编号后按下表依次加入标准蛋白溶液和氢氧化钠溶液。
1.2 加毕，搅匀，选用石英比色皿，用紫外分光光度计测定A280。
1.3 以每管标准蛋白毫克数为横坐标，对应的吸光度A280为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：2.1 取一支试管，加入一定量的待测蛋白质溶液，加入氢氧化钠溶液，混匀。
2.2 选用石英比色皿，用紫外分光光度计测定A280。
2.3 根据标准曲线，从横坐标上找到对应的吸光度A280，计算出待测蛋白质的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：绘制标准曲线后，发现蛋白质浓度与吸光度A280呈线性关系，相关系数R²大于0.99，说明该方法具有较高的准确性。
2. 样品测定：根据标准曲线，计算出待测蛋白质的浓度为x mg/mL。
六、实验讨论1. 实验过程中，要注意溶液的pH值，最好与标准曲线制定时的pH值一致，以减少pH对紫外吸收的影响。
2. 实验过程中，要注意避免样品中嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质对蛋白质浓度测定的干扰。
可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。
3. 实验结果表明，紫外吸收法测定蛋白质含量的方法简便、灵敏、快速，不消耗样品，适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
药典-蛋白质含量测定(紫外吸收法、Lowrry法、双缩脲法)
3.1.1 蛋白质含量第一法紫外吸收法（见EPO）用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。
以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm 和350nm的吸光度。
用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。
紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度A max，将A max对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。
计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。
蛋白质含量(mg/ml)=(A max -A光散色)/ 7.43 x 供试品稀释倍数x 10。
1.仪器的校正和鉴定1)波长允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2)吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。
3)杂散光碘化钠、亚硝酸钠2.测定法，1)对照品比较法(c x)= (A x/A R) c R，其中c x为供试品浓度；A x 为供试品溶液的吸光度c R为对照品浓度；A R为对照品溶液的吸光度。
2)吸收系数法通常吸收系数大于1003)计算分光光度法4)比色法第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量測定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂1〉酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。
取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。
紫外吸收法测蛋白质含量的方法(精)
紫外吸收法测蛋白质含量的方法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。
核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。
但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
1.280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。
蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。
通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。
由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
紫外吸收法测定蛋白质含量
紫外吸收法测定蛋白质含量
（一）目的
学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法。
（二）仪器
751型分光光度计
（三）原理
大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。
但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，warburg——等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
该方法是以酵母烯酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差。
（四）方法步骤
1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于751型分光光度计波长280nm和
260nm，分别读取A
280和A
260
，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白
对照。
2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。
蛋白质含量（mg/ml）=1.55A
280—0.76A
260
（五）实验报告
计算所测材料蛋白质的含量。
（六）思考题
1、这里介绍了几种测定蛋白质含量的方法，它们所根据的原理是什么？
2、试比较测定蛋白质含量的几种方法的优缺点。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理一、紫外吸收法。
紫外吸收法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是根据蛋白质在280nm波长处的特征吸收峰来进行测定。
在实验中，首先将待测样品溶解于适量的缓冲液中，然后使用紫外可见分光光度计测定样品在280nm处的吸光值，通过标准曲线的对照，可以计算出样品中蛋白质的含量。
二、比色法。
比色法是另一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂发生化学反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光值来计算样品中蛋白质的含量。
常用的试剂包括布拉德福试剂、伯杰试剂等，不同试剂适用于不同类型的蛋白质测定。
三、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质酰基发生还原反应的测定方法。
其原理是将待测样品与BCA试剂混合后在60℃条件下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
四、Lowry法。
Lowry法是一种以菁蓝G与蛋白质发生化学反应产生显色物质的测定方法。
其原理是将待测样品与碱液、菁蓝G和还原剂混合后在室温下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
五、总蛋白法。
总蛋白法是一种直接测定样品中总蛋白含量的方法，其原理是将待测样品与总蛋白试剂混合后在室温下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
总结，蛋白质含量的测定方法及原理有多种，每种方法都有其适用的样品类型和测定条件，研究人员可以根据自己的实验需要选择合适的方法进行蛋白质含量的测定工作。
希望本文所介绍的内容能为相关领域的研究工作提供一定的参考价值。
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紫外吸收法测蛋白质含量的方法
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，
例如生化制备中常用的（NH
4）2SO
4
等和大多数缓冲液不干扰测定。
特别适用于
柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。
核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。
但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
1.280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。
蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。
通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。
由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1%1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。
下式列出了蛋白质浓度与（A1%1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。
文献值A1%1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度= (A280´10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%浓度»10mg/ml)
2.280nm和260nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。
核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。
通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 » 1.8
纯核酸的光吸收比值：A280/A260 » 0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
3.215nm与225nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225
以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。
再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、
（NH
4）2SO
4
以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是
0.1N NaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
4.肽键测定法
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。
因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm 的光吸收值A238，以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。
未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
本方法比280nm吸收法灵敏。
但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。
所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。
若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。